以巨大口蘑菌絲為受體材料,利用含有雙元質(zhì)粒plasmid4的根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo),首次成功建立了巨大口蘑的遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過潮霉素抗性篩選、PCR鑒定和綠色熒光蛋白的檢測,表明潮霉素抗性基因(Hyg)已經(jīng)整合到巨大口蘑基因組中,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)在巨大口蘑菌絲中獲得表達(dá),并能夠穩(wěn)定遺傳。本研究建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的巨大口蘑遺傳轉(zhuǎn)化體系,為今后巨大口蘑的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1 雙元載體plasmid4圖譜

巨大口蘑菌株SCAU4由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院505實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；雙元載體plasmid4由福建農(nóng)林大學(xué)謝寶貴教授饋贈，質(zhì)粒圖譜見圖1。1.1.2酶、引物和化學(xué)試劑：

圖2 巨大口蘑菌絲在不同潮霉素濃度的PDA平板上的生長情況

在轉(zhuǎn)化過程中，采用一定濃度的Cef可以抑制農(nóng)桿菌的生長，然而并不清楚其是否會影響巨大口蘑菌絲的生長。觀察結(jié)果顯示巨大口蘑菌絲在Cef供試濃度的培養(yǎng)基中均能正常生長（圖3），其生長速度和對照組沒有明顯差異，說明此濃度范圍下不會影響菌絲生長。Cef對農(nóng)桿菌的毒性試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cef濃度大....

圖3 不同濃度的頭孢噻肟霉素對巨大口蘑菌絲生長的影響

圖2巨大口蘑菌絲在不同潮霉素濃度的PDA平板上的生長情況2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

圖4 質(zhì)粒plasmid4菌落PCR鑒定

采用凍融法將質(zhì)粒plasmid4轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得單菌落的轉(zhuǎn)化子。Hyg基因的PCR檢測結(jié)果與目的基因大小一致，表明plasmid4成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實驗（圖4）。2.4根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的巨大口蘑菌絲遺傳轉(zhuǎn)化

本文編號：4031625