指狀青霉是造成柑橘果實(shí)采后損失最嚴(yán)重的病原菌。因此,研究其致病機(jī)理,有效防治指狀青霉引起的病害是很有必要的。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)指狀青霉轉(zhuǎn)化的體系進(jìn)行優(yōu)化,穩(wěn)定高效地獲得大量突變轉(zhuǎn)化子,建立指狀青霉突變體庫。同時(shí),對(duì)已獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行比較分析,獲得了一株不使柑橘果實(shí)發(fā)病的突變菌株,對(duì)該菌株進(jìn)行了分子分析(PCR分析、Tail-PCR分析、Southern blot等),找出T-DNA插入位點(diǎn),通過RNAi技術(shù)探究突變位點(diǎn)的基因與指狀青霉致病性的關(guān)系。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘指狀青霉轉(zhuǎn)化條件:硝酸纖維素膜(NC膜)為承載膜,農(nóng)桿菌濃度OD600=0.6～0.8,指狀青霉孢子濃度為2×106 CFU/ml,共培養(yǎng)時(shí)25℃恒溫培養(yǎng)48h。此時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高,能達(dá)到約20-50個(gè)轉(zhuǎn)化子/皿。建立了含有一千多個(gè)轉(zhuǎn)化子的指狀青霉突變體庫。2.通過接種已獲得的轉(zhuǎn)化子于柑橘果實(shí)上,進(jìn)行對(duì)比分析,獲得了一株不使柑橘發(fā)病的菌株,通過Southern blot、Tail-PCR實(shí)驗(yàn),找到了兩個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)。3.針對(duì)兩個(gè)突變基因,通過RNAi技術(shù)初步研究了其與指狀青霉致病性的關(guān)系,...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 柑橘主要采后真菌病害
    1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展
        1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化的基本原理
        1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在絲狀真菌研究中已有的進(jìn)展
        1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)
        1.2.4 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化效率的因素
        1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在絲狀真菌研究中的應(yīng)用前景
    1.3 RNAi技術(shù)在基因功能研究上的進(jìn)展
        1.3.1 RNAi技術(shù)的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 RNAi技術(shù)在真菌基因功能上的研究進(jìn)展
        1.3.3 RNAi技術(shù)的特點(diǎn)
        1.3.4 RNAi技術(shù)在真菌中的應(yīng)用前景
    1.4 研究的目的及意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種，質(zhì)粒及其來源
        2.1.2 主要培養(yǎng)基和抗生素
        2.1.3 其他試劑及材料
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 指狀青霉對(duì)抗生素的敏感性檢測
        2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)指狀青霉轉(zhuǎn)化
        2.2.3 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性及分子檢測
        2.2.4 轉(zhuǎn)化子的致病力檢測
        2.2.5 Southern blot確定轉(zhuǎn)化子T-DNA插入拷貝數(shù)
        2.2.6 Tail-PCR、hi Tail-PCR擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列
        2.2.7 RNAi干涉載體構(gòu)建
        2.2.8 干涉轉(zhuǎn)化子干涉后目的基因表達(dá)程度檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 指狀青霉對(duì)抗生素的敏感性
        3.1.1 指狀青霉對(duì)潮霉素B抗性檢測
        3.1.2 指狀青霉對(duì)卡那霉素、G418抗性檢測
    3.2 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)指狀青霉轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
        3.2.1 預(yù)培養(yǎng)中AS對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        3.2.2 指狀青霉孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        3.2.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        3.2.4 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        3.2.5 不同承載膜對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
    3.3 待定轉(zhuǎn)化子PCR檢測
    3.4 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測
    3.5 轉(zhuǎn)化子的致病力檢測
    3.6 Southern blot分析
    3.7 Tail-PCR分析
    3.8 干涉載體構(gòu)建
    3.9 干涉程度檢測
4 討論
    4.1 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘指狀青霉轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
        4.1.1 預(yù)培養(yǎng)中AS對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.1.2 指狀青霉孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.1.3 共培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
        4.1.4 不同承載膜對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
    4.2 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性及分子分析
        4.2.1 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性分析
        4.2.2 轉(zhuǎn)化子的陽性分析
        4.2.3 轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)分析
    4.3 Tail-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列
    4.4 RNAi驗(yàn)證基因功能
展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：4031281