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利用VIGS對辣椒抗疫病候選基因Ca21394的功能分析

發(fā)布時間:2024-06-03 20:06
  辣椒(Capsicum annuum L.)是一種受人們喜愛的蔬菜,在全世界范圍內(nèi)廣泛種植。辣椒疫病由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起,在辣椒的整個生長階段都有可能發(fā)生,可導(dǎo)致成片辣椒死亡,嚴(yán)重影響了辣椒的生產(chǎn)。實踐證明,明確作物的抗病基因并用于選育抗病品種,才能從根本上預(yù)防某種病害的發(fā)生。本實驗室前期研究結(jié)果顯示,Ca21394為辣椒抗疫病的候選基因,但未進行功能驗證;病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)是一種快速沉默目的基因的方法,正在越來越多地用于植物候選基因的功能分析。本研究以辣椒抗疫病材料’G43’為試驗材料,利用VIGS技術(shù),分析Ca21394是否參與辣椒對辣椒疫霉菌的抗性反應(yīng)。研究結(jié)果如下:構(gòu)建了 VIGS重組載體pTRV2:Ca21394。采用對寄主影響較溫和的煙草脆裂病毒(TRV)為病毒載體,以辣椒葉片DNA為模板,在Ca21394基因序列5’端的一個外顯子區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物,克隆得到大小為438 bp的目的片段,經(jīng)過雙酶切檢測、測序驗證序列正確后,在pTRV2載體的XbaI和BamHI雙酶切位點間插入該目的片段,完成pTRV2:Ca21394重組載體...

【文章頁數(shù)】:67 頁

【學(xué)位級別】:碩士

【部分圖文】:

圖2-1?G43葉片DNA提取電泳檢測??

圖2-1?G43葉片DNA提取電泳檢測??

2.2.1辣椒葉片DNA提取??按照DNA提取試劑盒的操作步驟,提取抗疫病材料‘G43’的辣椒葉片DNA,??并進行電泳檢測,結(jié)果如圖2-1所示,得到清晰的條帶,表明已經(jīng)得到所需的DNA,??可用其進行下一步實驗。??M?1?2?3??2000?bp??750?bp??圖2-1?....


圖2-3目的片段與pEASY-T3載體連接轉(zhuǎn)化后PCR檢測??

圖2-3目的片段與pEASY-T3載體連接轉(zhuǎn)化后PCR檢測??

??片DNA為模板進行PCR擴增,電泳檢測結(jié)果顯示500?bp下方有清晰的條帶(圖2-2),??與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明,目的片段與Ca21394的CDS序列同源片段完全一??致,即該目的片段不包含內(nèi)含子,可用于下一步的重組載體構(gòu)建。??M?1?2?3??圖2-2?Ca213....


圖2-2?Ca21394基因擴增電泳檢測??

圖2-2?Ca21394基因擴增電泳檢測??

??片DNA為模板進行PCR擴增,電泳檢測結(jié)果顯示500?bp下方有清晰的條帶(圖2-2),??與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明,目的片段與Ca21394的CDS序列同源片段完全一??致,即該目的片段不包含內(nèi)含子,可用于下一步的重組載體構(gòu)建。??M?1?2?3??圖2-2?Ca213....


圖2-5?pTRV2和目的片段質(zhì)粒提取電泳檢測??

圖2-5?pTRV2和目的片段質(zhì)粒提取電泳檢測??

活化含pTRV2質(zhì)粒的大腸桿菌,利用pTRV2-F/R引物進行PCR擴增檢測,得到??的條帶大小應(yīng)為281?bp,電泳檢測結(jié)果表明,在200?bp條帶上方可看到單一清晰的條??帶(圖2-4),與預(yù)期結(jié)果一致,說明pTRV2質(zhì)?梢杂糜诤罄m(xù)試驗。??M?1?2?3?4??jm??圖....



本文編號:3988436

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