致病疫霉引起的晚疫病嚴(yán)重危害番茄的生產(chǎn),常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治番茄晚疫病的方法主要有噴施化學(xué)農(nóng)藥和傳統(tǒng)的雜交育種方法,長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成傷害,而傳統(tǒng)的雜交育種方法培育抗性品種,存在著周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程的手段對(duì)番茄進(jìn)行改良,獲得優(yōu)良的抗病品種,已成為番茄分子育種的新策略和新方法。研究發(fā)現(xiàn),WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用,但是在番茄中關(guān)于它的研究還鮮有報(bào)道。因此篩選番茄中參與抗病的WRKY轉(zhuǎn)錄因子,解析其作用機(jī)制,不僅可以為培育抗性番茄品種提供候選基因,也可為以后的分子育種工作提供了理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過電子克隆技術(shù)獲得了SpWRKY6基因。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明該蛋白的分子量為182.98 kDa,等電點(diǎn)為4.90,由739個(gè)氨基酸組成的不穩(wěn)定疏水蛋白,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白可能位于細(xì)胞核;含有兩個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2,屬于第一家族；對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子分析表明該基因上游啟動(dòng)子區(qū)域含有生物及非生物脅迫應(yīng)答的元件；利用genevestigator在線軟件對(duì)其響應(yīng)元素進(jìn)行預(yù)測(cè)表明...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖２．３破和Ａ：伽基因的溶解曲線??巧．２．３?Ｍｅｌｔｉｎｇ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?成?ａｎｄ?ｙｋｄ巧??

圖２．４幫Ｗ／化７６和誠(chéng)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．２．４?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅｓ?ｏｆ?ＳｐＷＲＫＹ６?ａｎｄ?Ａｃｔｉｎ??

２．３．６在番茄不同紀(jì)織中的表達(dá)分巧??抗病番茄品種Ｌ３７０８幼苗生長(zhǎng)到五葉期，Ｌ：ｉ？根、莖和葉為材料，采用ｑＲＴ－ＰＣ民方??法對(duì)卻Ｗ７化ｒ＜５基因的組織特異性進(jìn)行分析。如圖２．５所示，表明該基因在葉中表達(dá)量??較高，在莖巧表達(dá)量較低。??１．６?Ｊ?１??ａ??＾１１?■?....

圖２．７卻基因在水楊酸和榮莉酸甲醋處理下的表達(dá)譜??Ｆｉｇ．２．７?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｒｏｆｉｌｅｓ?ｏｆ?毎?ｉｎ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?化?ＳＡ?ａｎｄ?ＭｅＪＡ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ??

?０?３?１２?２４?３６?４８?７２?９６??Ｔｉｍｅ?（ｈ）??圖２．６毎Ｗ化樹：Ｍ基因在致病疫霉和灰霉菌處理下的表達(dá)譜??打ｇ．２．６?Ｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎ?ｐｒｏｆｉｌｅｓ?ｏｆ?毎）味７ＪＫＴ６?ｉｎ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?化戶．１’打典別ａｎｊ?ａｎｄ?瓦?ｃｍｅｒｅａ?ｉ....

圖３．１病毒誘導(dǎo)基因沉默片段的擴(kuò)增??Ｆｉｇ．３．１?Ａｉｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打?ｏｆ?ＶＩＧＳ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??

３．?３結(jié)果與分析??３．?３．?１成ＷＲｉｉ：化基因在沉默植株中表達(dá)量的檢測(cè)??反轉(zhuǎn)錄后的瓜ＮＡ為模板，利用特異性引物進(jìn)行ＰＣ民擴(kuò)增（圖３．１），目的片段??與ｐＭＤ?１９－Ｔ?Ｓｉｍｐｌｅ載體連接后的重姐質(zhì)粒進(jìn)行ＰＣ民和酶切鑒定（圖３．２），與預(yù)期的??目的片段大致相符，經(jīng)測(cè)....

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