Colourless non-ripening(cnr)番茄是一種典型的果實(shí)成熟突變體,這種突變主要是由于在番茄突變體cnr中LeSPL-CNR啟動(dòng)子上游有一段286 bp序列的胞嘧啶甲基化程度特別高,導(dǎo)致DNA甲基化的改變,但核酸序列沒(méi)有差異。目前,關(guān)于番茄轉(zhuǎn)錄因子CNR的研究主要在轉(zhuǎn)錄水平,然而蛋白合成后存在翻譯后水平的修飾,蛋白水平才是轉(zhuǎn)錄因子CNR發(fā)揮作用的水平。本研究通過(guò)番茄轉(zhuǎn)錄因子CNR的原核表達(dá)及純化、多克隆抗體的制備,在蛋白水平上研究番茄轉(zhuǎn)錄因子CNR。主要研究結(jié)果如下:(1)pET-CNR原核表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)GenBank中已發(fā)表的番茄CNR基因的序列設(shè)計(jì)引物,用于CNR基因的擴(kuò)增。以番茄總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行CNR基因擴(kuò)增,獲得與預(yù)期CNR編碼基因大小相符的片段。將該片段和表達(dá)載體pET-30a用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI切成雙黏性末端,純化后均用T₄連接酶進(jìn)行定向連接,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Rosetta進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)測(cè)序確定pET-CNR重組載體具有正確的編碼框,且測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表番茄CNR編碼序列...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖5CNR蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)20.0→M：Marker，1-3：?jiǎn)慰寺?br>
2019,35(2)5李玲等：番茄果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CNR的原核表達(dá)與純化及其抗體的制備大（圖6，泳道4），表明誘導(dǎo)劑IPTG的最適宜濃度為1.0mmol/L。單一條帶的收集液，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白含量，將蛋白含量≥1.0μg/μL的收集液合并，作為制備多克隆抗體的抗原。94.0→66....

圖2-1番茄果實(shí)總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig2-1TomatofruittotalRNAagarosegelelectrophoresis

第二章pET-CNR原核表達(dá)載體的構(gòu)建取結(jié)果茄果實(shí)總RNA，然后進(jìn)行2%的由圖2-1所示，可以看出，提取DNA的污染，能夠作為下一步理

圖2-2重組載體pET-CNR的菌液PCRFigure2-2RecombinantvectorpET-CNRbacteriostaticPCR

圖2-2重組載體pET-CNR的菌液PCRecombinantvectorpET-CNRbacterioM：Marker；1：目的片段

圖2-3重組質(zhì)粒pET-CNR的酶切驗(yàn)證

天津農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文酶切鑒定與測(cè)序，用酶XhoI和EcoRI雙酶2-3），420bp條帶的大小組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時(shí)進(jìn)行R序列（NM_001319308.1個(gè)堿基比對(duì)不上，所以后續(xù)

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