柑橘作為世界第一大水果,因其生物學(xué)特性而導(dǎo)致常規(guī)育種進(jìn)程較慢,甜橙基因組數(shù)據(jù)庫為基因工程育種提供了良好平臺,但是目前穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化及基因功能驗證體系并不成熟,瞬時表達(dá)技術(shù)可以實現(xiàn)短時間內(nèi)將目標(biāo)基因表達(dá)于受體細(xì)胞,為基因-蛋白質(zhì)研究提供了一種快捷方法。本研究以柑橘葉肉原生質(zhì)體為主要材料,用綠色熒光蛋白基因作為報告檢測基因,采用聚乙二醇(PEG)-Ca介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,在優(yōu)化原生質(zhì)體分離技術(shù)的前提下,設(shè)置PEG種類、PEG濃度、PEG-Ca溶液中甘露醇的濃度、轉(zhuǎn)化熱激處理時間、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒濃度以及共培養(yǎng)時間等變量,旨在提高柑橘原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率,并且對該體系進(jìn)行一定的應(yīng)用。具體結(jié)果如下:1、柑橘原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系的建立。以HB柚葉片為材料,采用真空滲透酶解方法,明顯縮短了酶解時間,減少了生物酶對原生質(zhì)體的傷害,提升了原生質(zhì)體的均一性,并且實現(xiàn)了柑橘果皮及汁胞原生質(zhì)體的首次分離與純化;PEG-Ca介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的優(yōu)化條件如下:PEG-Ca溶液中PEG種類為PEG4000,濃度為40%,甘露醇濃度為0.3M;熱激處理溫度為47℃,時間為7min;轉(zhuǎn)化質(zhì)粒濃度為15μg/3×105個原生質(zhì)體;轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１血球計數(shù)板示意圖

離原生質(zhì)體的活力，常溫黑暗環(huán)境靜置原生質(zhì)體１－２?ｈ。??２．２．６原生質(zhì)體密度統(tǒng)計及活力檢測方法??原生質(zhì)體密度統(tǒng)計一般采用血球計數(shù)板（如圖２－１所示），在普通光學(xué)顯??微鏡下統(tǒng)計完成，具體計數(shù)方法如下：?????柯個卞格面＾為１．〇ｍ，．容＾＾Ｏ?’ｍｎ＾?（ｕｌ）?＾???....

圖３－１陽性載體ＰＣＲ檢測結(jié)果圖

件進(jìn)行檢測（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕＩｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ）。??雙分子熒光互補實驗的陽性對照質(zhì)粒ＹＮ：：?ＳＩＷｏ和ＳＩＣｙｃＢ：：?ＹＣ進(jìn)行ＰＣＲ??檢測，ＰＣＲ擴(kuò)增引物，電泳檢測結(jié)果如圖３－１所示，與別Ｔｏ基因....

圖３－３原生質(zhì)體活力檢測圖

＇七（Ｖ??隱?Ｖ??圖３－２不同柑橘外植體分離的原生質(zhì)體。Ａ：葉肉；Ｂ：愈傷組織；??Ｃ：汁胞；Ｄ：果皮；標(biāo)尺：２０微米。??Ｆｉｇ．３－２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｅｘｐｌａｎｔｓ．?Ａ：?ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ；?Ｂ：Ｃａ....

圖３－２不同柑橘外植體分離的原生質(zhì)體

４２°Ｃ、４７°Ｃ、５２°Ｃ、５７°Ｃ恒定金屬浴溫度下，處理７ｍｉｎ，然后用ＨＤＡ法檢測??原生質(zhì)體活力，在Ｏｌｙｍｐｕｓ?１Ｘ７１倒置熒光顯微鏡下觀察，明場和熒光模式下原??生質(zhì)體狀態(tài)如圖３－３所示，同時用普通光學(xué)顯微鏡觀察血球計數(shù)板，并且統(tǒng)計??原生質(zhì)體個數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表３－....

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