大多數(shù)柑橘的單粒種子中合子胚與珠心胚共存,稱為柑橘種子特有的多胚現(xiàn)象。多胚性遺傳穩(wěn)定,是繁殖整齊一致的砧木的前提,也是柑橘常規(guī)雜交育種的主要障礙。已有研究表明,柑橘的珠心胚起始于胚囊周圍的珠心細胞。然而,由于取材限制,大部分研究以均質胚珠作為研究對象。并沒有考慮到不同細胞類型的特異性問題,對珠心胚起始發(fā)生機制認識還相當有限。激光顯微切割(Laser Microdissection,LMD)是一種精確取樣技術,在顯微鏡下精確定位目標組織和細胞,利用激光束從組織切片中快速切割、收集目標組織或細胞用于大分子物質的提取。該技術簡便、易行準確度高,已成功的運用于動植物研究,使得分離出珠心胚起始細胞成為可能。因此,利用該技術從特定細胞提取高質量RNA成為研究柑橘多胚形成分子機理的關鍵。本研究利用石蠟切片對‘伏令夏’橙(Citrus sinensis?Valencia‘)果實切片,觀察種子中珠心胚起始發(fā)生過程,確定珠心胚起始的關鍵時期;對比不同切片方法、不同多胚材料珠心胚起始細胞形態(tài)、數(shù)量確定了顯微切割配套切片方法及最佳材料;摸索顯微切割參數(shù)、切割量、RNA提取及檢測方法;成功切割收集‘華柑2號’椪...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
Abbreviations
第一章 前言
    1. 課題的提出
    2. 植物無融合生殖現(xiàn)象
    3. 柑橘珠心胚研究進展
    4. 激光顯微切割研究進展
        4.1 激光顯微切割技術發(fā)展和原理
        4.2 Leica AS LMD 7000的特點
        4.3 激光顯微切割技術結合組織切片技術
        4.4 激光顯微切割技術在植物研究中的應用
            4.4.1 植物生殖與胚胎研究
            4.4.2 基因表達分析
    5. 課題的目的與意義
第二章 激光顯微切割材料選擇
    1. 引言
    2. 材料與方法
        2.1 材料及其來源
        2.2 實驗方法
            2.2.1 ‘伏令夏’橙果實石蠟切片方法
            2.2.2 ‘伏令夏’橙果實冰凍切片方法
            2.2.3 不同柑橘多胚材料果實石蠟切片方法
            2.2.4 多胚柑橘種子采集及種子中胚數(shù)目統(tǒng)計
    3. 結果與分析
        3.1 伏令夏橙珠心胚起始發(fā)生過程觀察及切割時期確定
        3.2 適合柑橘珠心胚激光顯微切割的切片方法選擇
        3.3 適合柑橘珠心胚激光顯微切割的多胚材料篩選
        3.4 激光顯微切割所需樣品量估計
        3.5 不同柑橘多胚材料種子中胚數(shù)目統(tǒng)計
    4. 討論
        4.1 多胚柑橘材料胚珠中NEI細胞數(shù)量及出現(xiàn)時間、位置
        4.2 影響激光顯微切割NEI細胞材料篩選的因素
第三章 激光顯微切割技術體系構建
    1. 引言
    2. 材料與方法
        2.1 實驗材料
        2.2 石蠟切片方法
            2.2.1 石蠟切片的一般步驟
            2.2.2 適合柑橘果實的石蠟切片方法
        2.3 激光顯微切割方法
            2.3.1 開啟Leica AS LMD系統(tǒng)
            2.3.2 激光切割儀器校準
            2.3.3 激光顯微切割參數(shù)調試
            2.3.4 載玻片掃描
            2.3.5 勾畫目標細胞
            2.3.6 收集管準備
            2.3.7 正式切割及圖像數(shù)據收集
            2.3.8 取出收集管、關閉系統(tǒng)
        2.4 RNA提取
        2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA檢測
    3. 結果與分析
        3.1 石蠟切片的方法改進
            3.1.1 切面選擇
            3.1.2 切片厚度
            3.1.3 展片方法
            3.1.4 脫蠟方法
        3.2 激光顯微切割方法
        3.3 Aglient 2100 RNA質量檢測結果
        3.4 影響RNA質量的因素
    4. 討論
        4.1 石蠟切片過程對切割材料RNA質量的影響
        4.2 激光顯微切割過程對材料RNA質量影響
    5. 問題與展望
        5.1 問題
        5.2 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3866232