大多數(shù)柑橘的單粒種子中合子胚與珠心胚共存,稱為柑橘種子特有的多胚現(xiàn)象。多胚性遺傳穩(wěn)定,是繁殖整齊一致的砧木的前提,也是柑橘常規(guī)雜交育種的主要障礙。已有研究表明,柑橘的珠心胚起始于胚囊周圍的珠心細(xì)胞。然而,由于取材限制,大部分研究以均質(zhì)胚珠作為研究對(duì)象。并沒(méi)有考慮到不同細(xì)胞類型的特異性問(wèn)題,對(duì)珠心胚起始發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)還相當(dāng)有限。激光顯微切割(Laser Microdissection,LMD)是一種精確取樣技術(shù),在顯微鏡下精確定位目標(biāo)組織和細(xì)胞,利用激光束從組織切片中快速切割、收集目標(biāo)組織或細(xì)胞用于大分子物質(zhì)的提取。該技術(shù)簡(jiǎn)便、易行準(zhǔn)確度高,已成功的運(yùn)用于動(dòng)植物研究,使得分離出珠心胚起始細(xì)胞成為可能。因此,利用該技術(shù)從特定細(xì)胞提取高質(zhì)量RNA成為研究柑橘多胚形成分子機(jī)理的關(guān)鍵。本研究利用石蠟切片對(duì)‘伏令夏’橙(Citrus sinensis?Valencia‘)果實(shí)切片,觀察種子中珠心胚起始發(fā)生過(guò)程,確定珠心胚起始的關(guān)鍵時(shí)期;對(duì)比不同切片方法、不同多胚材料珠心胚起始細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量確定了顯微切割配套切片方法及最佳材料;摸索顯微切割參數(shù)、切割量、RNA提取及檢測(cè)方法;成功切割收集‘華柑2號(hào)’椪...

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
Abbreviations
第一章 前言
    1. 課題的提出
    2. 植物無(wú)融合生殖現(xiàn)象
    3. 柑橘珠心胚研究進(jìn)展
    4. 激光顯微切割研究進(jìn)展
        4.1 激光顯微切割技術(shù)發(fā)展和原理
        4.2 Leica AS LMD 7000的特點(diǎn)
        4.3 激光顯微切割技術(shù)結(jié)合組織切片技術(shù)
        4.4 激光顯微切割技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用
            4.4.1 植物生殖與胚胎研究
            4.4.2 基因表達(dá)分析
    5. 課題的目的與意義
第二章 激光顯微切割材料選擇
    1. 引言
    2. 材料與方法
        2.1 材料及其來(lái)源
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 ‘伏令夏’橙果實(shí)石蠟切片方法
            2.2.2 ‘伏令夏’橙果實(shí)冰凍切片方法
            2.2.3 不同柑橘多胚材料果實(shí)石蠟切片方法
            2.2.4 多胚柑橘種子采集及種子中胚數(shù)目統(tǒng)計(jì)
    3. 結(jié)果與分析
        3.1 伏令夏橙珠心胚起始發(fā)生過(guò)程觀察及切割時(shí)期確定
        3.2 適合柑橘珠心胚激光顯微切割的切片方法選擇
        3.3 適合柑橘珠心胚激光顯微切割的多胚材料篩選
        3.4 激光顯微切割所需樣品量估計(jì)
        3.5 不同柑橘多胚材料種子中胚數(shù)目統(tǒng)計(jì)
    4. 討論
        4.1 多胚柑橘材料胚珠中NEI細(xì)胞數(shù)量及出現(xiàn)時(shí)間、位置
        4.2 影響激光顯微切割NEI細(xì)胞材料篩選的因素
第三章 激光顯微切割技術(shù)體系構(gòu)建
    1. 引言
    2. 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2 石蠟切片方法
            2.2.1 石蠟切片的一般步驟
            2.2.2 適合柑橘果實(shí)的石蠟切片方法
        2.3 激光顯微切割方法
            2.3.1 開啟Leica AS LMD系統(tǒng)
            2.3.2 激光切割儀器校準(zhǔn)
            2.3.3 激光顯微切割參數(shù)調(diào)試
            2.3.4 載玻片掃描
            2.3.5 勾畫目標(biāo)細(xì)胞
            2.3.6 收集管準(zhǔn)備
            2.3.7 正式切割及圖像數(shù)據(jù)收集
            2.3.8 取出收集管、關(guān)閉系統(tǒng)
        2.4 RNA提取
        2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA檢測(cè)
    3. 結(jié)果與分析
        3.1 石蠟切片的方法改進(jìn)
            3.1.1 切面選擇
            3.1.2 切片厚度
            3.1.3 展片方法
            3.1.4 脫蠟方法
        3.2 激光顯微切割方法
        3.3 Aglient 2100 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
        3.4 影響RNA質(zhì)量的因素
    4. 討論
        4.1 石蠟切片過(guò)程對(duì)切割材料RNA質(zhì)量的影響
        4.2 激光顯微切割過(guò)程對(duì)材料RNA質(zhì)量影響
    5. 問(wèn)題與展望
        5.1 問(wèn)題
        5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3866232