芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)為芍藥科芍藥屬的多年生宿根草本花卉,其良好的觀賞特點和極高的切花品質(zhì)逐漸被世界上越來越多的人們賞識,市場需求極高。但芍藥種子有上、下胚軸雙重休眠的特性,其生長周期過長,在實際生產(chǎn)中有很大障礙,尤其是對新品種選育和雜交育種工作產(chǎn)生了巨大的影響。本研究以母本為芍藥品種‘粉玉奴’,父本為芍藥品種‘粉玉樓’的雜交種子為試驗材料。選取沙藏0d(PDB,下胚軸萌發(fā)前)和沙藏40d(PDA,下胚軸萌發(fā)后的露白種子)的種子為試驗材料,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析芍藥種子下胚軸萌發(fā)前后的基因表達差異。找到差異表達基因中與下胚軸休眠與萌發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵基因,并進行克隆及原核表達分析。試驗中主要的結(jié)果如下：1.轉(zhuǎn)錄組測序共得到120181964條Unigene序列,從PDB種子的RNA中獲得了58107876條Unigene序列,從PDA種子的RNA中獲得了6274088條Unigene序列。序列經(jīng)過濾后共獲得107929718條clean reads。本研究采用de novo方法,對測序數(shù)據(jù)進行了拼接,共獲得123577個contig,其中大于2kb的有1336...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 芍藥概述
    1.2 芍藥種子休眠的研究進展
    1.3 種子休眠的激素調(diào)控機制
        1.3.1 ABA在種子萌發(fā)過程中的作用
        1.3.2 BR在種子萌發(fā)過程中的作用
        1.3.3 乙烯在種子萌發(fā)過程中的作用
        1.3.4 GA在種子萌發(fā)過程中的作用
    1.4 DELLA蛋白的研究進展
        1.4.1 DELLA蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 DELLA蛋白的功能
    1.5 RNA-Seq技術(shù)的研究進展
        1.5.1 RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展
        1.5.2 RNA-Seq的優(yōu)勢
        1.5.3 RNA-Seq研究基因的差異表達
    1.6 本研究的目的意義及技術(shù)路線
        1.6.1 本研究的目的意義
        1.6.2 本研究的內(nèi)容和技術(shù)路線
第二章 芍藥種子下胚軸萌發(fā)前后轉(zhuǎn)錄組樣品的測序
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 測序材料準備
        2.1.3 試驗儀器與試劑
    2.2 試驗方法
        2.2.1 操作前有關(guān)器皿及藥品的處理
        2.2.2 芍藥種子總RNA的提取
        2.2.3 總RNA的檢測
        2.2.4 cDNA文庫的構(gòu)建和Illumina HiSeq2000測序
        2.2.5 數(shù)據(jù)過濾和de novo拼接
        2.2.6 基因功能注釋及分類
        2.2.7 預(yù)測編碼蛋白框CDS
        2.2.8 SSR分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 RNA提取質(zhì)量評估
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序及序列拼接
        2.3.3 基因功能注釋結(jié)果
        2.3.4 Unigene的GO功能分類注釋
        2.3.5 Unigene的KOG功能分類注釋
        2.3.6 KEGG pathways分析
        2.3.7 SSR信息分析
        2.3.8 Unigene的編碼蛋白(CDS)預(yù)測結(jié)果
    2.4 小結(jié)與討論
        2.4.1 小結(jié)
        2.4.2 討論
第三章 芍藥種子下胚軸萌發(fā)前后的差異表達基因分析
    3.1 試驗材料
    3.2 試驗方法
        3.2.1 差異基因表達水平聚類分析
        3.2.2 差異基因GO富集分析
        3.2.3 差異基因KEGG富集分析
        3.2.4 qRT-PCR分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 差異表達基因的篩選
        3.3.2 差異基因表達模式聚類
        3.3.3 差異表達基因的GO功能顯著性富集結(jié)果
        3.3.4 差異表達基因的Pathway顯著性富集分析
        3.3.5 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與種子萌發(fā)相關(guān)的基因的qRT-PCR驗證
    3.4 小結(jié)與討論
        3.4.1 小結(jié)
        3.4.2 討論
第四章 DELLA蛋白PlGAI1基因的克隆及功能分析
    4.1 試驗材料
        4.1.1 試驗材料及處理
        4.1.2 菌株與載體
        4.1.3 試驗試劑
        4.1.4 儀器與耗材
        4.1.5 溶液的配制
        4.1.6 試驗所用引物生物信息學(xué)軟件
    4.2 試驗方法
        4.2.1 操作前有關(guān)器皿及藥品的處理
        4.2.2 芍藥種子總RNA的提取
        4.2.3 cDNA的合成
        4.2.4 芍藥DELLA蛋白PlGAI1基因全長ORF的克隆
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 芍藥種子總RNA的提取
        4.3.2 芍藥DELLA蛋白PlGAI1基因全長的克隆
        4.3.3 PlGAI1基因編碼的蛋白質(zhì)序列分析
        4.3.4 PlGAI1基因編碼的蛋白質(zhì)相關(guān)結(jié)構(gòu)的分析
        4.3.5 PlGAl1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析
        4.3.6 PlGAI1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析
        4.3.7 亞細胞的初步定位
    4.4 小結(jié)與討論
        4.4.1 小結(jié)
        4.4.2 討論
第五章 DELLA蛋白PlGAI1基因的原核表達分析
    5.1 試驗材料
        5.1.1 試驗材料及處理
        5.1.2 菌株與載體
        5.1.3 主要生化試劑
        5.1.4 儀器與耗材
    5.2 試驗方法
        5.2.1 RNA的提取及cDNA的制備
        5.2.2 引物設(shè)計與PCR擴增
        5.2.3 表達載體pET-32a(+)質(zhì)粒的線性化
        5.2.4 PCR產(chǎn)物與表達載體pET-32a(+)的同源重組
        5.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        5.2.6 質(zhì)粒提取與鑒定
        5.2.7 克隆鑒定
        5.2.8 重組蛋白的表達
        5.2.9 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測
        5.2.10 重組蛋白的純化
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 RNA的檢測和cDNA的檢測
        5.3.2 提取質(zhì)粒的檢測
        5.3.3 PlGAI1基因編碼的蛋白在大腸桿菌中的表達
        5.3.4 目的蛋白的純化
    5.4 小結(jié)與討論
        5.4.1 小結(jié)
        5.4.2 討論
第六章 結(jié)論
    6.1 芍藥種子下胚軸萌發(fā)前后轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
    6.2 芍藥種子下胚軸萌發(fā)前后的差異基因
    6.3 成功克隆芍藥種子PlGAI1基因
    6.4 芍藥種子PlGAI1基因編碼的蛋白在大腸桿菌中明顯表達
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3832487