西瓜(Citrullus lanatus)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培和食用的園藝作物,具有很高的經(jīng)濟價值。低溫是常見的環(huán)境脅迫因子,嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。西瓜屬于喜溫性作物,在早春和反季節(jié)設(shè)施栽培過程中,常常受到低溫脅迫,影響產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。研究西瓜低溫響應(yīng)基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不僅可以解析西瓜的低溫耐受性機制,也能為西瓜耐低溫品種的遺傳改良提供理論依據(jù),具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。模式植物上的研究表明,MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)低溫及抵御低溫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本課題在前期研究中,從低溫脅迫下西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一個顯著上調(diào)表達的基因Cla007586,經(jīng)鑒定為一個典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。該MYB轉(zhuǎn)錄因子是否具有調(diào)控西瓜低溫耐受性的功能及其是如何調(diào)控的,目前尚不清楚。為回答以上問題,本研究克隆了該基因,構(gòu)建了過表達載體對煙草進行了遺傳轉(zhuǎn)化,分析了過表達煙草植株在低溫脅迫下的表型和生理生化指標(biāo)的變化,同時,通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了其在西瓜中的潛在互作蛋白。主要研究結(jié)果如下:1.序列分析表明,Cla007586基因是一個典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子,開放閱讀框長861 bp,...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究進展
        1.2.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點與分類
        1.2.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能
        1.2.4 MYB蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究
    1.3 低溫脅迫對植物的影響
        1.3.1 低溫脅迫對植物生理水平的影響
        1.3.2 低溫脅迫對植物分子水平的影響
    1.4 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 低溫脅迫下Cla007586的表達分析
        2.1.1 植物材料培養(yǎng)及低溫處理
        2.1.2 CTAB法提取基因組DNA
        2.1.3 Trans Zol法提取基因組RNA
        2.1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.1.5 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計
        2.1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析
    2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Cla007586基因的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.1 構(gòu)建pHellsgate8-Cla007586植物過表達載體
        2.2.2 制備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)
        2.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)
        2.2.4 農(nóng)桿菌葉盤法介導(dǎo)轉(zhuǎn)化栽培煙草
        2.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定
    2.3 Cla007586過表達煙草植株的低溫抗性鑒定
        2.3.1 植物材料培養(yǎng)及低溫處理
        2.3.2 電導(dǎo)率的測定
        2.3.3 丙二醛含量的測定
    2.4 Cla007586的亞細(xì)胞定位
        2.4.1 構(gòu)建pK7FWG2-Cla007586表達載體
        2.4.2 制備并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)
        2.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化本氏煙草及定位觀察
    2.5 Cla007586的互作蛋白篩選
        2.5.0 構(gòu)建西瓜葉片低溫脅迫均一化cDNA文庫
        2.5.1 構(gòu)建酵母誘餌載體
        2.5.2 制備酵母感受態(tài)
        2.5.3 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)
        2.5.4 檢測誘餌載體的自激活性
        2.5.5 檢測誘餌載體的毒性
        2.5.6 Mating法酵母雙雜交篩庫
        2.5.7 陽性菌斑測序結(jié)果分析
        2.5.8 互作蛋白的點對點驗證
3 結(jié)果與分析
    3.1 Cla007586基因的序列分析
    3.2 Cla007586基因的表達分析
    3.3 Cla007586的亞細(xì)胞定位
    3.4 Cla007586過表達煙草植株的獲得
    3.5 Cla007586過表達煙草植株的低溫抗性分析
        3.5.1 轉(zhuǎn)基因與野生型煙草低溫處理下的表型差異
        3.5.2 轉(zhuǎn)基因與野生型煙草低溫處理下細(xì)胞膜透性的變化
        3.5.3 轉(zhuǎn)基因與野生型煙草低溫處理下丙二醛含量的變化
    3.6 Cla007586互作蛋白的篩選及分析
        3.6.1 誘餌載體pGBKT7-Cla007586的毒性效應(yīng)
        3.6.2 誘餌載體pGBKT7-Cla007586的自激活效應(yīng)及AbA濃度篩選
        3.6.3 誘餌載體與酵母文庫雙雜交篩選
        3.6.4 雜交陽性菌斑的PCR鑒定及測序
        3.6.5 陽性菌斑測序序列分析及功能預(yù)測
    3.7 Cla007586候選互作蛋白的點對點驗證
4 討論
    4.1 Cla007586轉(zhuǎn)錄因子的表達及亞細(xì)胞定位
    4.2 Cla007586轉(zhuǎn)錄因子的功能分析
    4.3 Cla007586互作蛋白分析
參考文獻
附錄Ⅰ：Mating陽性克隆測序序列
附錄Ⅱ：常用培養(yǎng)基的配置
附錄Ⅲ：碩士期間發(fā)表論文和申請專利
致謝



本文編號：3791415