蓮藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是中國用量較大的一種水生蔬菜,藥食兩用,其整個植株十個部位中有六個部位入藥。蓮藕具有很高的食用價值和藥用價值,多酚氧化酶是植物中廣泛存在的抗氧化酶,它同時也是導(dǎo)致蓮藕等果蔬農(nóng)產(chǎn)品采后褐變的重要原因。課題組前期通過酵母雙雜的方法篩選出蓮藕多酚氧化酶(Nn PPO1)與金魚草素合成酶(Nn AUS)、半胱氨酸脫硫酶(Nn Cys)之間存在蛋白互作,但互作模式并不清楚,在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步篩選、驗證蓮藕Nn PPO1與何蛋白互作,并明確它們的組織特異性表達(dá)和亞細(xì)胞定位,逐步探索Nn PPO1在蓮藕中的作用機(jī)制,為精準(zhǔn)抑制其活性奠定基礎(chǔ),對于采后控制蓮藕褐變、延長其產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。主要試驗結(jié)果如下:1.本試驗將抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、半胱氨酸過氧化物酶、過氧化物酶等酶的基因序列,分別連接至p GADT7載體上,與課題組前期構(gòu)建的JDPPO1-BD載體(Nn PPO1去除N端導(dǎo)肽部分所構(gòu)載體)共轉(zhuǎn)化酵母,以篩選互作蛋白,結(jié)果表明Nn PPO1與Nn CAT1之間存在互作關(guān)系,經(jīng)過自激活和毒性試驗表明,Nn C...

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 蓮藕
        1.1.1 蓮藕簡介
        1.1.2 蓮藕研究現(xiàn)狀
    1.2 多酚氧化酶研究進(jìn)展
        1.2.1 PPO分子結(jié)構(gòu)的特點
        1.2.2 PPO的分布與定位
        1.2.3 PPO基因的多家族性
        1.2.4 PPO基因的誘導(dǎo)
        1.2.5 PPO的生理功能
    1.3 金魚草素合酶、半胱氨酸脫硫酶、過氧化氫酶的介紹
    1.4 蛋白互作的技術(shù)
        1.4.1 蛋白互作的主要技術(shù)
        1.4.2 雙分子熒光互補(BiFC)分析技術(shù)
    1.5 研究的目的和意義
    1.6 研究內(nèi)容
        1.6.1 蓮藕NnPPO1互作蛋白的篩選
        1.6.2 NnPPO1互作模式的分析
        1.6.3 互作蛋白的亞細(xì)胞定位和組織特異性表達(dá)分析
        1.6.4 生物信息學(xué)分析
第二章 通過酵母雙雜交篩選NnPPO1的互作蛋白
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 試驗試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 試驗方法
        2.2.1 獵物載體的構(gòu)建
        2.2.2 NnPPO1互作蛋白的篩選
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 目的基因的克隆及載體的構(gòu)建
        2.3.2 酵母雙雜交篩選NnPPO1的互作蛋白
        2.3.3 互作蛋白的毒性和自激活檢測
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 NnPPO與 NnAUS、NnCys及 NnCAT1 互作分析
    3.1 試驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與質(zhì)粒
        3.1.3 試驗試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基及浸染液的配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 BIFC載體的構(gòu)建
        3.2.2 雙分子熒光互補試驗驗證互作蛋白
        3.2.3 Y2H分析NnPPO1與NnCAT1、NnAUS、NnCys互作位點
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 BiFC驗證蛋白互作的真實性
        3.3.2 NnPPO1與NnCAT1、NnAUS、NnCys氨基酸序列的分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 互作蛋白的亞細(xì)胞定位與組織特異性表達(dá)
    4.1 試驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株與質(zhì)粒
        4.1.3 試驗試劑
        4.1.4 培養(yǎng)基及浸染液的配制
    4.2 試驗方法
        4.2.1 互作蛋白的亞細(xì)胞定位
        4.2.2 組織特異性表達(dá)分析
        4.2.3 生物信息學(xué)分析內(nèi)容
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 互作蛋白的亞細(xì)胞定位
        4.3.2 組織特異性表達(dá)分析
        4.3.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論和創(chuàng)新點
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個人簡介



本文編號：3775772