香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型引起的毀滅性的土傳維管束香蕉真菌病害,已經對全球香蕉產業(yè)造成嚴重影響。由于香蕉抗性栽培品種的缺乏,以及對病原菌致病分子機理和香蕉抗性分子機制的不清楚等原因,目前還沒有真正十分有效的防治方法。為了闡明香蕉枯萎病菌的致病分子機理,為香蕉抗病品種培育提供方向及防治藥物開發(fā)提供靶標,本文從香蕉枯萎病菌4號(Foc4)和1號小種(Foc1)的比較蛋白質組分析出發(fā),選取了 9個在Foc1和Foc4中差異表達的潛在致病相關蛋白,進行了基因克隆,并運用熒光定量PCR方法進行基因表達分析。選取酰胺轉移酶基因構建基因敲除載體,進行了基因敲除和基因功能驗證。主要的研究結果如下:1.從尖孢鐮刀菌1號小種和4號小種的比較蛋白質組學分析中選擇9個差異蛋白,利用熒光定量PCR對基因表達量進行了分析,從中篩選出4個差異表達基因。2.擴增了酰胺轉移酶的左右側同源臂,并成功構建了帶GFP(綠色熒光蛋白)標記敲除載體。3.利用PEG介導的原生質體轉化法對Foc4菌株進行了基因敲除,獲得了 10個帶有GFP(綠色熒光蛋白)和HPH(潮霉素磷酸轉移酶)標記的轉化子。4.通過對轉化子的各種驗證試...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 導論
    1.1 香蕉簡介
    1.2 香蕉枯萎病與尖孢鐮刀菌
        1.2.1 香蕉枯萎病
        1.2.2 尖孢鐮刀菌
        1.2.3 尖孢鐮刀菌致病機理
        1.2.4 香蕉枯萎病發(fā)病主要癥狀
        1.2.5 香蕉枯萎病菌的生理小種與危害
        1.2.6 香蕉抗病機理及目前的香蕉枯萎病病害的治理
    1.3 香蕉枯萎病菌的致病分子機制
    1.4 利用比較蛋白質組學尋找致病基因
    1.5 尖孢鐮刀菌的遺傳轉化
        1.5.1 絲狀真菌的幾種主要轉化方法
        1.5.2 轉化DNA與基因組的整合
    1.6 本實驗的研究目的與意義
    1.7 技術路線
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質粒
        2.1.2 試劑盒
        2.1.3 試劑及配液
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 前期蛋白質組實驗數(shù)據(jù)整理
        2.2.2 Foc1和Foc4的培養(yǎng)
        2.2.3 香蕉的處理及采樣
        2.2.4 香蕉枯萎病菌RNA提取
        2.2.5 反轉錄cDNA
        2.2.6 基因全長克隆
        2.2.7 基因表達分析——熒光定量PCR
        2.2.8 香蕉枯萎病菌4號生理小種基因組DNA的提取
        2.2.9 基因敲除載體的構建
        2.2.10 原生質體的制備
        2.2.11 PEG介導的原生質體轉化
        2.2.12 轉化子基因敲除驗證
        2.2.13 敲除子的菌落形態(tài)觀察
        2.2.14 敲除子的玻璃紙穿透實驗
        2.2.15 敲除子的離體葉片實驗
        2.2.16 敲除子的蘋果切片定殖實驗
        2.2.17 敲除子的過氧化氫耐受性實驗
        2.2.18 敲除子纖維素利用實驗
        2.2.19 敲除子滲透壓脅迫實驗
        2.2.20 敲除子細胞壁選擇性壓力實驗
        2.2.21 敲除子致病性實驗
3 結果與分析
    3.1 目的基因克隆
    3.2 基因表達分析
    3.3 目的基因敲除載體的構建
        3.3.1 同源臂的擴增
        3.3.2 載體構建
        3.3.3 基因敲除載體的酶切驗證
    3.4 原生質體的獲得
    3.5 敲除轉化子的驗證
        3.5.1 潮霉素抗性篩選
        3.5.2 轉化子的共聚焦顯微鏡觀察
        3.5.3 轉化子PCR驗證
    3.6 敲除子的表型及生物特性分析
        3.6.1 菌落形態(tài)
        3.6.2 玻璃紙穿透
        3.6.3 蘋果切片穿透試驗
        3.6.4 香蕉離體葉片試驗
        3.6.5 過氧化氫耐受試驗
        3.6.6 纖維素利用
        3.6.7 滲透壓脅迫試驗
        3.6.8 細胞壁選擇性脅迫試驗
    3.7 致病力測定
4 討論
    4.1 基因表達分析
    4.2 敲除載體的構建
    4.3 原生質體的轉化
    4.4 轉化子的檢測與基因敲除
    4.5 表型及致病性檢測
5 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3766034