香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴�；鸵鸬臍缧缘耐羵骶S管束香蕉真菌病害,已經(jīng)對(duì)全球香蕉產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。由于香蕉抗性栽培品種的缺乏,以及對(duì)病原菌致病分子機(jī)理和香蕉抗性分子機(jī)制的不清楚等原因,目前還沒有真正十分有效的防治方法。為了闡明香蕉枯萎病菌的致病分子機(jī)理,為香蕉抗病品種培育提供方向及防治藥物開發(fā)提供靶標(biāo),本文從香蕉枯萎病菌4號(hào)(Foc4)和1號(hào)小種(Foc1)的比較蛋白質(zhì)組分析出發(fā),選取了 9個(gè)在Foc1和Foc4中差異表達(dá)的潛在致病相關(guān)蛋白,進(jìn)行了基因克隆,并運(yùn)用熒光定量PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)分析。選取酰胺轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建基因敲除載體,進(jìn)行了基因敲除和基因功能驗(yàn)證。主要的研究結(jié)果如下:1.從尖孢鐮刀菌1號(hào)小種和4號(hào)小種的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析中選擇9個(gè)差異蛋白,利用熒光定量PCR對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行了分析,從中篩選出4個(gè)差異表達(dá)基因。2.擴(kuò)增了酰胺轉(zhuǎn)移酶的左右側(cè)同源臂,并成功構(gòu)建了帶GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)記敲除載體。3.利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法對(duì)Foc4菌株進(jìn)行了基因敲除,獲得了 10個(gè)帶有GFP(綠色熒光蛋白)和HPH(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子。4.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的各種驗(yàn)證試...

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 導(dǎo)論
    1.1 香蕉簡(jiǎn)介
    1.2 香蕉枯萎病與尖孢鐮刀菌
        1.2.1 香蕉枯萎病
        1.2.2 尖孢鐮刀菌
        1.2.3 尖孢鐮刀菌致病機(jī)理
        1.2.4 香蕉枯萎病發(fā)病主要癥狀
        1.2.5 香蕉枯萎病菌的生理小種與危害
        1.2.6 香蕉抗病機(jī)理及目前的香蕉枯萎病病害的治理
    1.3 香蕉枯萎病菌的致病分子機(jī)制
    1.4 利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)尋找致病基因
    1.5 尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化
        1.5.1 絲狀真菌的幾種主要轉(zhuǎn)化方法
        1.5.2 轉(zhuǎn)化DNA與基因組的整合
    1.6 本實(shí)驗(yàn)的研究目的與意義
    1.7 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑盒
        2.1.3 試劑及配液
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 前期蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理
        2.2.2 Foc1和Foc4的培養(yǎng)
        2.2.3 香蕉的處理及采樣
        2.2.4 香蕉枯萎病菌RNA提取
        2.2.5 反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.2.6 基因全長(zhǎng)克隆
        2.2.7 基因表達(dá)分析——熒光定量PCR
        2.2.8 香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種基因組DNA的提取
        2.2.9 基因敲除載體的構(gòu)建
        2.2.10 原生質(zhì)體的制備
        2.2.11 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.2.12 轉(zhuǎn)化子基因敲除驗(yàn)證
        2.2.13 敲除子的菌落形態(tài)觀察
        2.2.14 敲除子的玻璃紙穿透實(shí)驗(yàn)
        2.2.15 敲除子的離體葉片實(shí)驗(yàn)
        2.2.16 敲除子的蘋果切片定殖實(shí)驗(yàn)
        2.2.17 敲除子的過(guò)氧化氫耐受性實(shí)驗(yàn)
        2.2.18 敲除子纖維素利用實(shí)驗(yàn)
        2.2.19 敲除子滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)
        2.2.20 敲除子細(xì)胞壁選擇性壓力實(shí)驗(yàn)
        2.2.21 敲除子致病性實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 目的基因克隆
    3.2 基因表達(dá)分析
    3.3 目的基因敲除載體的構(gòu)建
        3.3.1 同源臂的擴(kuò)增
        3.3.2 載體構(gòu)建
        3.3.3 基因敲除載體的酶切驗(yàn)證
    3.4 原生質(zhì)體的獲得
    3.5 敲除轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證
        3.5.1 潮霉素抗性篩選
        3.5.2 轉(zhuǎn)化子的共聚焦顯微鏡觀察
        3.5.3 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
    3.6 敲除子的表型及生物特性分析
        3.6.1 菌落形態(tài)
        3.6.2 玻璃紙穿透
        3.6.3 蘋果切片穿透試驗(yàn)
        3.6.4 香蕉離體葉片試驗(yàn)
        3.6.5 過(guò)氧化氫耐受試驗(yàn)
        3.6.6 纖維素利用
        3.6.7 滲透壓脅迫試驗(yàn)
        3.6.8 細(xì)胞壁選擇性脅迫試驗(yàn)
    3.7 致病力測(cè)定
4 討論
    4.1 基因表達(dá)分析
    4.2 敲除載體的構(gòu)建
    4.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
    4.4 轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)與基因敲除
    4.5 表型及致病性檢測(cè)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3766034