龍眼(Dimocarpus longanLour.)是無(wú)患子科(Sapindaceae)常綠木本果樹(shù),是我國(guó)南亞熱帶名貴特產(chǎn),歷史上有南方“桂圓”北“人參”之稱。龍眼種子(胚胎)等發(fā)育情況與龍眼果實(shí)產(chǎn)量品質(zhì)密切相關(guān)。越來(lái)越多證據(jù)表明植物體胚發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性不僅由特異的DNA序列控制,還受表觀遺傳調(diào)控,其中最重要的修飾之一就是DNA甲基化,一定程度的DNA甲基化有利于植物體胚的正常發(fā)育。近年的研究報(bào)道表明,miRNA,特別是24nt的1miRNA與DNA甲基化密切相關(guān)。然而,目前關(guān)于龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中1miRNA介導(dǎo)靶基因甲基化機(jī)制研究較少,并且其合成途徑中Dicer-like蛋白(DCL蛋白)在龍眼體胚發(fā)生中的功能特異性以及響應(yīng)外界環(huán)境作用機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究表明,miRNA在龍眼體胚發(fā)生中具有重要作用,而mmiRNA的產(chǎn)生依賴于DCL酶的切割,提示DCL在龍眼體胚中同樣起著調(diào)控作用。鑒于此,本研究以龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),對(duì)龍眼胚性愈傷組織DlDCLs基因家族成員進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析;以龍眼基因組數(shù)據(jù)為參考,對(duì)DlDCLs進(jìn)行啟動(dòng)子克隆和順式作...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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第一章 引言
    1 植物DCL基因研究進(jìn)展
        1.1 植物DCL的作用
        1.2 DCL與植物生長(zhǎng)發(fā)育
        1.3 DCL與植物抗逆性
        1.4 DCL與植物激素代謝
    2 植物miRNA的研究進(jìn)展
        2.1 植物miRNA及1miRNA的合成和作用機(jī)理
        2.2 miRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中的作用
            2.2.1 miRNA參與植物生長(zhǎng)發(fā)育
            2.2.2 miRNA植物生物和非生物脅迫
        2.3 miRNA與植物體胚發(fā)生
    3 DNA甲基化的研究進(jìn)展
        3.1 DNA甲基化機(jī)制
        3.2 RNA介導(dǎo)的DNA甲基化
        3.3 DNA甲基化與植物體胚發(fā)生
    4 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究進(jìn)展
        4.1 激素對(duì)植物體胚發(fā)生的影響
        4.2 植物體胚發(fā)生過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控
    5 龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究進(jìn)展
    6 研究的意義及主要內(nèi)容
        6.1 研究意義
        6.2 研究的主要內(nèi)容
第二章 龍眼DlDCLs基因家族成員的克隆與生物信息學(xué)分析
    第一節(jié) 龍眼DlDCLs基因家族成員的克隆
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 龍眼總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
                1.2.2 龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及DlDCLs基因序列的獲得
                1.2.3 龍眼DlDCLs基因家族成員的引物設(shè)計(jì)和克隆
                1.2.4 龍眼DlDCLs基因家族成員目的片段的回收和測(cè)序
                1.2.5 龍眼DlDCLs基因家族成員cDNA序列分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)DCL基因差異表達(dá)分析
            2.2 龍眼DlDCLs基因成員的克隆驗(yàn)證
                2.2.1 龍眼DlDCL1基因的克隆驗(yàn)證
                2.2.2 龍眼DlDCL2基因的克隆驗(yàn)證
                2.2.3 龍眼DlDCL3基因的克隆驗(yàn)證
                2.2.4 龍眼DlDCL4基因的克隆驗(yàn)證
            2.3 龍眼DlDCLs基因氨基酸序列分析及親緣關(guān)系分析
        3 討論
    第二節(jié) 龍眼DlDCLs基因家族成員的生物信息學(xué)分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 龍眼DlDCLs理化性質(zhì)分析
            2.2 龍眼DlDCLs信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)
            2.3 龍眼DlDCLs跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析
            2.4 龍眼DlDCLs卷螺旋預(yù)測(cè)與分析
            2.5 龍眼DlDCLs磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            2.6 龍眼DlDCLs蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)
            2.7 DCL系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
        3 討論
第三章 龍眼DlDCLs基因家族成員啟動(dòng)子的克隆與分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 DNA提取
            1.2.2 龍眼DlDCLs基因家族成員啟動(dòng)子序列的獲得和克隆
            1.2.3 生物信息學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 龍眼DlDCLs基因家族成員啟動(dòng)子序列獲得
        2.2 龍眼DlDCLs基因家族成員啟動(dòng)子順式元件功能預(yù)測(cè)分析
            2.2.1 龍眼DlDCLs基因家族成員5'調(diào)控序列光反應(yīng)元件分析
            2.2.2 龍眼DlDCLs基因家族成員5'調(diào)控序列激素響應(yīng)元件分析
            2.2.3 龍眼DlDCLs基因家族成員5'調(diào)控序列逆境響應(yīng)元件分析
            2.2.4 龍眼DlDCLs基因家族成員5'調(diào)控序列生長(zhǎng)相關(guān)元件分析
            2.2.5 龍眼DlDCLs基因家族成員5'調(diào)控序列未知相關(guān)元件分析
        2.3 龍眼DlDCLs基因家族成員啟動(dòng)子CpG島的預(yù)測(cè)
    3 討論
第四章 龍眼DlDCLs表達(dá)模式分析
    第一節(jié) DlDCLs在龍眼體胚和組織器官發(fā)生過(guò)程中表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成
                1.2.2 龍眼DCL基因qPCR引物設(shè)計(jì)和分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 DlDCLs在龍眼非胚性與胚性培養(yǎng)物中的表達(dá)模式分析
            2.2 DlDCLs在龍眼紅核子不同組織器官中的表達(dá)模式分析
        3 討論
            3.1 龍眼DlDCLs在非胚性愈傷組織和龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中可能具有功能的交叉和互補(bǔ)
            3.2 龍眼DlDCLs可能參與葉片和花器官發(fā)育
    第二節(jié) 龍眼DlDCLs在激素和非生物脅迫處理下的表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.2.1 不同激素處理下龍眼胚性愈傷組織的獲得
                1.2.2 不同非生物脅迫下龍眼胚性愈傷組織的獲得
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 龍眼DlDCLs在不同激素處理下表達(dá)模式分析
                2.1.1 不同濃度生長(zhǎng)素(2,4-D)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.1.2 不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.1.3 不同濃度水楊酸(SA)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.1.4 不同濃度赤霉素(GA3)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.1.5 不同濃度脫落酸(ABA)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.1.6 不同濃度乙烯(ETH)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
            2.2 非生物脅迫處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.2.1 不同光質(zhì)處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.2.2 不同濃度蔗糖處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.2.3 不同溫度處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
                2.2.4 鹽脅迫處理下DlDCLs的表達(dá)模式分析
        3 討論
            3.1 龍眼DlDCLs可能響應(yīng)多種激素應(yīng)答
            3.2 龍眼DlDCLs可能響應(yīng)多種非生物脅迫的應(yīng)答
第五章 5-氮胞苷(5-azaC)對(duì)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞和DlDCLs表達(dá)的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
            1.2.1 不同濃度5-azaC的MS+2,4-D_1.0mg/L固體培養(yǎng)基配制
            1.2.2 不同濃度5-azaC的MS+2,4-D_1.0mg/L液體培養(yǎng)基配制
            1.2.3 龍眼胚性愈傷組織形態(tài)觀察
            1.2.4 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成
    2 結(jié)果與分析
        2.1 5-azaC處理下龍眼愈傷組織生長(zhǎng)量觀察
        2.2 5-azaC處理下龍眼愈傷組織細(xì)胞形態(tài)觀察
        2.3 5-氮胞苷(5-azaC)處理下DlDCLs基因表達(dá)模式分析
    3 討論
        3.1 DNA甲基化影響龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育
        3.2 龍眼DlDCLs可能參與DNA甲基化過(guò)程
第六章 龍眼DlDCLs基因沉默對(duì)體胚發(fā)生早期的影響
    第一節(jié) 龍眼DlDCLs基因在體胚發(fā)生早期的時(shí)空表達(dá)
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 龍眼胚性愈傷組織懸浮材料的獲得
                1.1.2 龍眼胚性愈傷組織早期體胚發(fā)生階段材料的獲得
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 龍眼體胚發(fā)生早期細(xì)胞分化觀察
            2.2 龍眼體胚發(fā)生早期DIDCLs定量表達(dá)分析
        3 討論
    第二節(jié) DlDCL3和DlDCL4在龍眼體胚發(fā)生早期的功能驗(yàn)證
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 siRNA靶點(diǎn)篩選與qPCR檢測(cè)
                1.2.2 DlDCLs基因抑制后對(duì)龍眼體胚早期細(xì)胞形態(tài)觀察
        2 結(jié)果分析
            2.1 龍眼DlDCL3和DlDCL4基因siRNA抑制靶點(diǎn)篩選
            2.2 龍眼DlDCL3基因抑制后對(duì)龍眼體胚形態(tài)建成的影響
            2.3 龍眼DlDCL4基因抑制后對(duì)龍眼體胚形態(tài)建成的影響
        3 討論
第七章 小結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 龍眼DlDCLs基因cDNA序列信息
    附錄2 龍眼DlDCLs基因啟動(dòng)子序列信息
在學(xué)碩期間發(fā)表論文、獲獎(jiǎng)及參加學(xué)術(shù)會(huì)議情況
致謝



本文編號(hào)：3763285