生長素響應(yīng)因子Auxin Response Factors（ARFs）在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵的作用,同時也參與了植物體內(nèi)眾多的生理生化過程。ARFs基因所編碼的蛋白質(zhì)可以與生長素響應(yīng)基因啟動子中特定的響應(yīng)元件結(jié)合,從而調(diào)節(jié)植物的各個生長發(fā)育過程。本文旨在運(yùn)用分子生物學(xué)手段系統(tǒng)性地分析柑橘中的ARFs基因家族的特征,并對一些關(guān)鍵基因進(jìn)行功能分析。主要結(jié)果如下:1.本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了柑橘（甜橙）中共有19個不同的ARF基因,分別命名為CiARF1-CiARF19。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)都具有非常典型的特征,包含三個不同的結(jié)構(gòu)域:分別為氨基末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA Binding Domain,DBD）、中間結(jié)構(gòu)域（Middle Region,MR）、羧基末端的AUX/IAA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C-terminal Domain,CTD）。本研究通過對柑橘中的ARF基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析、染色體定位分析、編碼蛋白的保守motif分析以及基因啟動子區(qū)的順式作用元件分析,從而更加全面地解析了柑橘中ARF基因家族的特征。2.通過定量PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),CiARF在甜橙不同的組織和不同的發(fā)育階... 

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 ARF基因家族蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 在植物中ARF基因的激活、互作和調(diào)控機(jī)理
        1.2.3 ARFs在植物生長發(fā)育過程中的作用
        1.2.4 CRISPR/Cas9基因敲除原理及其應(yīng)用
    1.3 本研究的目的和主要內(nèi)容
2 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和載體質(zhì)粒
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息分析方法
            2.2.1.1 柑橘ARF基因的鑒定與分離
            2.2.1.2 保守模體分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測
            2.2.1.3 Ci ARFs的基因結(jié)構(gòu)和染色體定位
            2.2.1.4 Ci ARFs的系統(tǒng)進(jìn)化和啟動子序列分析
        2.2.2 Ci ARFs基因表達(dá)分析相關(guān)方法
            2.2.2.1 總RNA的提取
            2.2.2.2 第一鏈c DNA合成
            2.2.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測
            2.2.2.4 定量引物設(shè)計
        2.2.3 Ci ARF16超表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.3.1 目的片段的擴(kuò)增
            2.2.3.2 目的片段回收
            2.2.3.3 AT克隆
            2.2.3.4 目的片段重組引物設(shè)計
            2.2.3.5 線性化克隆載體制備
            2.2.3.6 一步法重組反應(yīng)
            2.2.3.7 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2.4 CRISPR載體的構(gòu)建
        2.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
        2.2.6 柑橘愈傷組織轉(zhuǎn)化
        2.2.7 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化
3 結(jié)果與分析
    3.1 Ci ARFs基因的鑒定
    3.2 Ci ARFs基因系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析及基因注釋
    3.3 Ci ARF蛋白的結(jié)構(gòu)分析
    3.4 Ci ARF基因在染色體上的分布
    3.5 Ci ARF基因啟動子區(qū)順式模體預(yù)測
    3.6 Ci ARF基因在甜橙不同器官中表達(dá)情況分析
    3.7 甜橙果實(shí)成熟過程Ci ARF基因的表達(dá)情況分析
    3.8 經(jīng)外源植物激素處理后Ci ARF基因表達(dá)分析
    3.9 Ci ARF8和Ci ARF16基因功能的驗(yàn)證
        3.9.1 構(gòu)建CRISPR-Cas9載體
            3.9.1.1 目的片段與線性化載體重組連接
            3.9.1.2 農(nóng)桿菌目的基因的PCR陽性檢測
        3.9.2 柑橘愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.9.3 鑒定轉(zhuǎn)基因的愈傷組織
        3.9.4 Ci ARF16超表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.9.4.1 目的基因和質(zhì)粒載體的酶切
            3.9.4.2 重組反應(yīng)
            3.9.4.3 農(nóng)桿菌目的基因PCR檢測
        3.9.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化
        3.9.6 擬南芥篩選培養(yǎng)及其陽性鑒定
        3.9.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型統(tǒng)計分析
4 討論
    4.1 Ci ARF在系統(tǒng)進(jìn)化上的保守性
    4.2 Ci ARF表達(dá)模式的差異性
    4.3 CIRISP-Cas9在柑橘轉(zhuǎn)化中存在的問題
    4.4 35S::Ci ARF16轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型變化及展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    1. 實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基配方
        1.1 擬南芥轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
        1.2 擬南芥篩選培養(yǎng)基配方
        1.3 伏令夏橙愈傷組織生長及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
    2. 研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]生長素反應(yīng)因子作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 史夢雅,李陽,張巍,劉悅萍.  生物技術(shù)通報. 2012(08)
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[4]生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及參與的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 張娟.  生命科學(xué)研究. 2009(03)



本文編號：3718224