發(fā)布時(shí)間：2022-10-09 17:48

　　啟動(dòng)子對研究基因功能和植物生長發(fā)育的調(diào)控具有重要價(jià)值。組成型表達(dá)的啟動(dòng)子,如CaMV35S啟動(dòng)子,因其能促進(jìn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá),現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究。雖然它可以驅(qū)動(dòng)外源基因在宿主中高度表達(dá),但由于其組成型表達(dá)的特點(diǎn),它也會(huì)在宿主植物整個(gè)生長發(fā)育過程中的各個(gè)時(shí)期和各個(gè)組織中高度表達(dá),從而過量表達(dá)目的基因,對植物的生長發(fā)育造成阻礙。組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以克服這些缺點(diǎn),它們可以在特定組織或特殊誘導(dǎo)條件下表達(dá),植物外源基因的表達(dá)可被精確地控制,避免了目標(biāo)基因過量表達(dá)對于植物造成的不良影響。百合在觀賞方面具有重要的價(jià)值,但它易受不良環(huán)境（如低溫,干旱,病害等）的影響。因此研究百合抗寒相關(guān)基因甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶（GPAT）基因的啟動(dòng)子對百合及其它植物的抗逆分子育種具有重要的價(jià)值。本研究以抗寒品種岷江百合為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用染色體步移的技術(shù),對岷江百合GPAT基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆,并對其功能進(jìn)行了初步研究。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.根據(jù)岷江百合GPAT基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,以岷江百合基因組DNA為模板,利用染色體步移技術(shù),用了接頭PCR和FPNI-PCR的兩種方法... 

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物抗寒基因GPAT
        1.1.1 GPAT基因應(yīng)答機(jī)制
        1.1.2 GPAT基因研究進(jìn)展
    1.2 植物啟動(dòng)子
        1.2.1 啟動(dòng)子概述
            1.2.1.1 啟動(dòng)子基本特征
        1.2.2 啟動(dòng)子類型
            1.2.2.1 組成型啟動(dòng)子
            1.2.2.2 組織特異性啟動(dòng)子
            1.2.2.3 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
        1.2.3 啟動(dòng)子克隆方法
        1.2.4 啟動(dòng)子功能研究方法
    1.3 百合抗寒的研究進(jìn)展
    1.4 本試驗(yàn)的目的及意義
    1.5 研究技術(shù)路線
第二章 岷江百合GPAT基因啟動(dòng)子的克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與克隆載體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器及常用生物學(xué)軟件
        2.1.5 培養(yǎng)基及常用試劑的配置方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 民江百合的組培
        2.2.2 民江百合基因組DNA的提取
        2.2.3 染色體步移法擴(kuò)增GPAT基因啟動(dòng)子序列
            2.2.3.1 接頭PCR法克隆啟動(dòng)子序列
            2.2.3.2 FPNI-PCR法克隆啟動(dòng)子序列
        2.2.4 GPAT基因5'調(diào)控序列的測定
            2.2.4.1 PCR產(chǎn)物的回收
            2.2.4.2 回收的目的DNA片段與pGM-T的連接
            2.2.4.3 連接產(chǎn)物的的轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選
            2.2.4.4 陽性克隆的PCR鑒定及測序
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 岷江百合的組培
        2.3.2 岷江百合基因組DNA的提取
        2.3.3 染色體步移法擴(kuò)增GPAT基因啟動(dòng)子序列
            2.3.3.1 第一次接頭PCR擴(kuò)增
            2.3.3.2 第二次接頭PCR法擴(kuò)增
            2.3.3.3 第一次FPNI-PCR法擴(kuò)增
            2.3.3.4 第二次FPNI-PCR擴(kuò)增
        2.3.4 接頭PCR與FPNI-PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子比較
        2.3.5 GPAT基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析
    2.4 討論
第三章 岷江百合GPAT基因啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 主要儀器及生物軟件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 GPAT基因啟動(dòng)子5’端缺失片段的克隆
        3.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.2.1 GPAT啟動(dòng)子缺失片段中間載體的構(gòu)建
            3.2.2.2 GPAT啟動(dòng)子缺失體和pCAMBIA 1304的質(zhì)粒提取
            3.2.2.3 GPAT啟動(dòng)子缺失體質(zhì)粒和載體pCAMBIA 1304質(zhì)粒的酶切處理
            3.2.2.4 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 GPAT基因啟動(dòng)子5’端缺失體的克隆
        3.3.2 缺失體重組質(zhì)粒和pCAMBIA1304植物表達(dá)載體的雙酶切
        3.3.3 GFP/GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測
    3.4 討論
第四章 GPAT基因啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)分析及煙草轉(zhuǎn)化植株的獲得和鑒定
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株與表達(dá)載體
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 主要儀器及常用生物軟件
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 煙草組培苗的培養(yǎng)
        4.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草
            4.2.2.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
            4.2.2.2 重組農(nóng)桿菌的鑒定
        4.2.3 組織化學(xué)染色
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-GPATp導(dǎo)入農(nóng)桿菌的驗(yàn)證
        4.3.2 GUS報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測啟動(dòng)子的活性
    4.4 煙草轉(zhuǎn)化植株的獲得
        4.4.1 煙草的轉(zhuǎn)化
        4.4.2 煙草轉(zhuǎn)化植株的檢測
            4.4.2.1 煙草轉(zhuǎn)化植株的DNA提取
            4.4.2.2 PCR檢測
        4.4.3 結(jié)果與分析
            4.4.3.1 煙草的轉(zhuǎn)化
            4.4.3.2 PCR驗(yàn)證煙草轉(zhuǎn)化植株
    4.5 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]擬南芥葉片和角果特異性啟動(dòng)子的篩選與分析[J]. 郭燕,詹高淼,楊曉燕,華瑋,呂應(yīng)堂.  中國油料作物學(xué)報(bào). 2015(01)
[2]植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 李田,孫景寬,劉京濤.  生物技術(shù)通報(bào). 2015(02)
[3]SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測小麥紋枯病菌體系的建立和應(yīng)用[J]. 孫炳劍,陳清清,袁虹霞,施艷,李洪連.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(01)
[4]低溫脅迫對不同百合主要生理指標(biāo)的影響[J]. 王玲麗,賈文杰,馬璐琳,崔光芬,吳麗芳,王祥寧,段青,蔣亞蓮,王繼華.  植物生理學(xué)報(bào). 2014(09)
[5]一個(gè)新水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離與鑒定[J]. 趙紅玉,徐磊,魏溪涓,鄧敏娟,王芳,易可可.  中國水稻科學(xué). 2014(04)
[6]組織特異性啟動(dòng)子在作物基因工程中的研究進(jìn)展[J]. 賀紅霞,陳亮,林春晶,柳青.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2014(09)
[7]低溫脅迫下草菇甘油‐3‐磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)變化的研究[J]. 姜威,趙妍,汪虹,馮愛萍,陳明杰.  菌物學(xué)報(bào). 2014(02)
[8]植物GPATs基因研究進(jìn)展[J]. 劉聰,肖旦望,施春霖,胡學(xué)芳,鄔克彬,官春云,熊興華.  遺傳. 2013(12)
[9]甜瓜CmACOⅠ啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)研究[J]. 毛娟,陸璐,陳佰鴻,禇明宇,趙長增.  園藝學(xué)報(bào). 2013(06)
[10]蓖麻GPAT基因SNPs及與油脂含量的關(guān)聯(lián)分析[J]. 徐宸敏,邱旭,劉小燭.  綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào). 2012(05)

博士論文
[1]野生百合卷丹（Lilium lancifolium）響應(yīng)低溫信號(hào)的分子機(jī)制研究[D]. 王晶懋.北京林業(yè)大學(xué) 2015
[2]落葉松體細(xì)胞胚TCTP與NFYA基因克隆及其在ABA調(diào)控過程中的表達(dá)機(jī)制[D]. 張立峰.中國林業(yè)科學(xué)研究院 2014
[3]溫度脅迫下番茄葉綠體甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶基因的功能分析[D]. 隋娜.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]甘藍(lán)型油菜GPAT6基因的克隆與功能分析[D]. 劉聰.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]巴斯德畢赤酵母新啟動(dòng)子PGCW14的調(diào)控結(jié)構(gòu)和應(yīng)用研究[D]. 張軒薇.華南理工大學(xué) 2013



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