露地菊為菊科多年生草本植物,為東北地區(qū)主要園林花卉品種之一。品種繁多,具有一定的經(jīng)濟價值;管理粗放,具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽堿能力。大部分露地菊品種花期集中在9-10月份,在東北地區(qū)已進入秋季,氣溫較低,在一定程度上影響了露地菊的經(jīng)濟價值。因此,研究露地菊抗寒機理,提升現(xiàn)有露地菊品種的抗寒性,培育出抗寒能力更強的露地菊品種有著重要意義。本研究中,以露地菊’火焰’為主要試驗材料,克隆得到植物抗寒ICE-CBF/DREB途徑中的關鍵基因CmICE1、CmDREBa和CmDREBb,利用生物信息學相關軟件對抗寒基因進行了分析;使用實時定量PCR的方法分析抗寒基因的表達模式;構建了帶有安全標記基因的植物表達載體pCAMBIA1301-PMI-CmICEI,利用農(nóng)桿菌介導的葉盤侵染法轉化露地菊’火焰’,獲得了轉基因植株并對轉基因植株的抗寒性進行鑒定。得到結論如下:（1）克隆得到三個抗寒基因CmICE1、CmDREBa和CmDREBb,其中CmDREBa和CmDREBb是CmICE1的下游基因;CmICE1基因CDS區(qū)全長1410bp,編碼470個氨基酸;CmDREBa基因CDS區(qū)全長579 b... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 露地菊的由來及應用
    1.2 植物抗寒生理的研究進展
        1.2.1 丙二醛、脯氨酸含量與植物抗寒性的關系
        1.2.2 酶系統(tǒng)與植物抗寒性間的關系
        1.2.3 相對電導率與植物抗寒性間的關系
    1.3 植物抗寒分子機制的研究進展
        1.3.1 植物寒信號響應的研究進展
        1.3.2 植物抗寒信號轉導途徑的研究進展
        1.3.3 ICE基因的研究進展
    1.4 轉基因技術中安全標記基因的研究
        1.4.1 可視化的安全標記基因
        1.4.2 糖代謝相關的安全標記基因
        1.4.3 其它安全標記基因
    1.5 本研究的目的及意義
2 露地菊抗寒基因的克隆
    2.1 試驗材料
    2.2 試驗試劑
    2.3 試驗方法
        2.3.1 露地菊總RNA的提取
        2.3.2 露地菊總RNA的電泳檢測
        2.3.3 反轉錄合成cDNA
        2.3.4 PCR擴增
        2.3.5 PCR產(chǎn)物的回收純化
        2.3.6 PCR產(chǎn)物與載體的連接與轉化
        2.3.7 陽性克隆的挑取、檢測與測序
        2.3.8 抗寒基因的生物信息學分析
    2.4 結果與分析
        2.4.1 露地菊總RNA的提取
        2.4.2 抗寒基因全長的PCR擴增及序列測定
        2.4.3 抗寒基因的生物信息學分析
    2.5 討論
    2.6 本章小結
3 露地菊抗寒基因的表達分析
    3.1 試驗材料
    3.2 試驗試劑
    3.3 試驗方法
        3.3.1 露地菊不同組織部位樣品的采集
        3.3.2 露地菊光周期測定樣品的采集
        3.3.3 露地菊的4℃處理方法及樣品的采集
        3.3.4 露地菊總RNA的提取及電泳檢測
        3.3.5 總RNA反轉錄為cDNA
        3.3.6 實時定量PCR
    3.4 結果與分析
        3.4.1 抗寒基因的組織特異性表達
        3.4.2 抗寒基因的光周期性表達
        3.4.3 抗寒基因4℃處理下的表達
    3.5 討論
    3.6 本章小結
4 CmICE1載體構建及遺傳轉化露地菊'火焰'
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗試劑
    4.3 試驗方法
        4.3.1 引物設計
        4.3.2 利用attB-CmICE1-F/R引物進行第一次PCR
        4.3.3 利用attB-adapter-F/R引物進行第二次PCR
        4.3.4 BP反應
        4.3.5 LR反應
        4.3.6 三親雜交法轉化農(nóng)桿菌
        4.3.7 培養(yǎng)基的配制
        4.3.8 預培養(yǎng)
        4.3.9 菌液侵染與共培養(yǎng)
        4.3.10 甘露糖篩選培養(yǎng)
        4.3.11 不定芽的生根培養(yǎng)
    4.4 結果與分析
        4.4.1 目的基因的兩次PCR
        4.4.2 BP反應菌液PCR及測序檢測
        4.4.3 LR反應菌液PCR及測序檢測
        4.4.4 三親雜交法轉化農(nóng)桿菌
        4.4.5 露地菊'火焰'遺傳轉化
    4.5 討論
    4.6 本章小結
5 抗性植株的分子檢測及表型觀察
    5.1 露地菊抗性植株的PCR檢測
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 試驗試劑
        5.1.3 試驗方法
        5.1.4 結果與分析
    5.2 轉基因植株相關基因表達量分析
        5.2.1 試驗材料
        5.2.2 試驗試劑
        5.2.3 試驗方法
        5.2.4 結果與分析
    5.3 轉基因植株寒處理下相關基因表達量分析
        5.3.1 試驗材料
        5.3.2 試驗試劑
        5.3.3 試驗方法
        5.3.4 結果與分析
    5.4 轉基因植株的表型觀察
        5.4.1 試驗材料
        5.4.2 試驗試劑
        5.4.3 試驗方法
        5.4.4 結果與分析
    5.5 討論
    5.6 本章小結
結論
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3663726