西瓜（Citrulluslanatus）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和水果,富含各種營(yíng)養(yǎng)成分。瓜氨酸作為西瓜的營(yíng)養(yǎng)成分之一,是一種有效的氧自由基清除劑,在西瓜抗逆性代謝中發(fā)揮重要作用。而在人體中,瓜氨酸是參與尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物,有調(diào)節(jié)人體機(jī)能的作用。鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）不僅是瓜氨酸合成代謝的關(guān)鍵酶,通過(guò)催化鳥(niǎo)氨酸和氨甲醜磷酸反應(yīng)合成瓜氨酸和磷酸鹽,而且參與了高等植物嘧啶與多胺的形成。對(duì)西瓜OCT的分離純化有助于對(duì)該酶在西瓜瓜氨酸合成代謝及抗逆調(diào)控中作用的研究,從而為改良西瓜品種及選育新品種提供參考依據(jù);而對(duì)西瓜OCT基因的克隆、表達(dá)及純化,為研究OCT基因的功能及催化反應(yīng)機(jī)理等研究奠定基礎(chǔ)。本研究對(duì)西瓜OCT的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,利用熱處理、鹽析及透析法對(duì)西瓜OCT進(jìn)行分離純化,并對(duì)OCT的一些酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。同時(shí)利用分子生物學(xué)方法克隆并分析了西瓜OCT基因,構(gòu)建了重組OCT蛋白原核表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)、純化、復(fù)性及活性分析。結(jié)果如下:1、西瓜OCT提取的最佳條件:Tris-HCl緩沖液pH值為8.5、料液比為1:5及提取時(shí)間為4 h;利用熱處理、鹽析及透析純化所得該酶的純... 

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 西瓜的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 西瓜的起源與分布
        1.1.2 西瓜的營(yíng)養(yǎng)與價(jià)值
        1.1.3 西瓜的種植現(xiàn)狀
    1.2 西瓜瓜氨酸的研究現(xiàn)狀
    1.3 西瓜瓜氨酸合成中鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的分離提純研究
        1.3.2 鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
        1.3.3 鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因結(jié)構(gòu)研究
        1.3.4 鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的分布定位研究
    1.4 技術(shù)路線
    1.5 目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 酶與試劑盒
        2.1.3 化學(xué)試劑與儀器設(shè)備
        2.1.4 PCR引物設(shè)計(jì)
        2.1.5 常用試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
        2.2.2 西瓜OCT的分離純化
        2.2.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
        2.2.4 西瓜葉片總RNA的提取
        2.2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.2.6 PCR擴(kuò)增
        2.2.7 PCR產(chǎn)物純化
        2.2.8 重組克隆載體的構(gòu)建
        2.2.9 生物信息學(xué)分析
        2.2.10 重組pMD18-T-OCT質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.11 開(kāi)放閱讀框的克隆
        2.2.12 原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定
        2.2.13 工程菌的表達(dá)
        2.2.14 重組pET-30a-OCT蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.2.15 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
        2.2.16 重組pET-30a-OCT蛋白的質(zhì)譜鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
        3.1.1 不同緩沖液pH值對(duì)OCT活力的影響
        3.1.2 不同料液比對(duì)OCT活力的影響
        3.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)OCT活力的影響
        3.1.4 西瓜OCT提取條件的優(yōu)化
    3.2 西瓜OCT的分離純化
        3.2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.2.2 熱處理
        3.2.3 鹽析
        3.2.4 透析
        3.2.5 西瓜OCT的分離純化
    3.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
        3.3.1 酶促反應(yīng)的最適溫度
        3.3.2 酶促反應(yīng)的最造pH值
        3.3.3 酶促反應(yīng)的K_m與V_(max)值的測(cè)定
        3.3.4 金屬離子及抑制劑對(duì)酶活力的影響
        3.3.5 西瓜總RNA的提取
        3.3.6 PCR擴(kuò)增
        3.3.7 生物信息學(xué)分析
        3.3.8 重組表達(dá)載體pET-30a-OCT的雙酶切鑒定
        3.3.9 重組pET30a-OCT的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.10 重組pET-30a-OCT誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.3.11 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
        3.3.12 重組pET-30a-OCT的質(zhì)譜鑒定
4 討論
    4.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
    4.2 西瓜OCT的分離純化
    4.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
    4.4 西瓜OCT蛋白的基因克隆與生物信息學(xué)分析
    4.5 重組pET-30a-OCT的誘導(dǎo)表達(dá)
    4.6 重組pET-30a-OCT誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
    4.7 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
    4.8 重組pET-30a-OCT蛋白的質(zhì)譜鑒定
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3647163