百合是世界著名的球根花卉,具有較高的觀賞價值。然而目前大量珍貴野生資源瀕臨滅絕,種質(zhì)保存方面尚存在困難,國內(nèi)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種較少。體細胞胚發(fā)生對于解決百合種質(zhì)保存、遺傳性狀改良、種球繁育等問題具有重要意義,但目前有關(guān)于百合體胚發(fā)生的相關(guān)分子機制研究尚未明確。本課題組研究表明miR171在調(diào)控百合體胚發(fā)生過程中起到重要作用,本研究克隆了細葉百合（Lilium pumilum DC.Fisch）miR171前體（pre-miR171）;使用qRT-PCR技術(shù)探討百合體細胞胚發(fā)生過程中pre-miR171及內(nèi)源誘捕靶標（eTM171）的表達模式;使用雙酶切方法進行miR171過表達載體的構(gòu)建,并采用小串聯(lián)模擬靶標技術(shù)及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了mi R171沉默和敲除載體,為揭示百合體胚發(fā)生過程中miR171的產(chǎn)生、加工和調(diào)控過程,以及深入研究百合體胚發(fā)生過程中eTM-miR171-SCL6的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。主要試驗結(jié)果如下:1.lpu-pre-miR171a/b的克隆及表達分析根據(jù)miRNA前體具有高度保守的特點,成功克隆得到了細葉百合lpu-miR171a、lpu... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 百合體細胞胚發(fā)生的最新研究進展
    1.2 植物體細胞胚發(fā)生過程中關(guān)鍵miRNA的研究進展
        1.2.1 植物miRNA的生物合成
        1.2.2 miRNA成熟體參與調(diào)控植物體胚發(fā)生的研究進展
        1.2.3 miRNA前體在體胚發(fā)生過程中的研究進展
    1.3 miR171的研究進展
        1.3.1 miR171家族的研究進展
        1.3.2 miR171調(diào)控植物體細胞胚發(fā)生的研究進展
    1.4 植物內(nèi)源誘捕靶標(eTM)的研究進展
    1.5 植物miRNA功能的研究進展
    1.6 CRISPR/Cas9技術(shù)在園藝植物基因組編輯中的研究進展
    1.7 本文研究的目的與意義
2 細葉百合pre-miR171a/b的克隆及表達分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 主要試驗儀器設(shè)備及耗材
        2.1.3 常用試劑及培養(yǎng)基的配制
        2.1.4 百合體胚總RNA提取及cDNA合成
        2.1.5 pre-miR171a/b的PCR擴增反應(yīng)
        2.1.6 PCR擴增產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及測序
        2.1.7 對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析
        2.1.8 pre-miR171的qRT-PCR分析
        2.1.9 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 細葉百合體細胞胚總RNA提取結(jié)果
        2.2.2 lpu-pre-miR171a/b的克隆
        2.2.3 lpu-pre-miR171a/b二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.2.4 pre-miR171a/b引物特異性分析
        2.2.5 百合體胚發(fā)生過程中pre-miR171的表達分析
    2.3 討論
        2.3.1 pre-miR171a/b序列分析
        2.3.2 百合體胚發(fā)生過程中miR171與pre-miR171表達關(guān)聯(lián)性分析
3 百合體胚發(fā)生過程中eTM171表達分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 RNA提取及cDNA合成
        3.1.3 eTM171的qRT-PCR引物設(shè)計
        3.1.4 eTM171的qRT-PCR分析
        3.1.5 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 eTM171引物特異性分析
        3.2.2 百合體胚發(fā)生過程中eTM171的表達分析
    3.3 討論
        3.3.1 百合體胚發(fā)生過程中miR171及其eTM的表達關(guān)聯(lián)性分析
        3.3.2 百合體胚發(fā)生過程中eTM-miR171-SCL6調(diào)控網(wǎng)絡(luò)初探
4 細葉百合miR171a/b的載體構(gòu)建
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 試驗所用的菌株與載體
        4.1.3 miR171a/b過表達載體的構(gòu)建
        4.1.4 miR171a/bSTTM表達載體的構(gòu)建
        4.1.5 miR171a/b打靶載體的構(gòu)建
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 miR171a/b過表達載體的構(gòu)建
        4.2.2 miR171a/bSTTM表達載體的構(gòu)建
        4.2.3 百合miR171a/b打靶載體的構(gòu)建
    4.3 討論
結(jié)論
主要創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang.  Science China（Life Sciences）. 2017(05)
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博士論文
[1]兩種中國原產(chǎn)百合體細胞胚發(fā)生及miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)初步解析[D]. 張靜.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]MiRNA生物合成過程的系統(tǒng)動力學(xué)研究[D]. 王霞.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013

碩士論文
[1]五種不同品系切花百合體細胞胚發(fā)生的組織形態(tài)學(xué)觀察[D]. 聶茹霞.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]兩種中國原產(chǎn)百合體細胞胚發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)初探[D]. 薛冰洋.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]百合體胚發(fā)生過程中miR166及其靶基因的鑒定與表達分析[D]. 楊越.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[4]基于體細胞胚發(fā)生的五種切花百合高效再生體系建立[D]. 嚴瑞.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[5]百合體胚發(fā)生過程中miR171及其靶基因SCL6的鑒定與表達分析[D]. 賈娜娜.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[6]Tae-miR9677前體及其小串聯(lián)模擬靶標表達載體構(gòu)建及小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 李趙杰.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[7]白菜miR158的表達及其在花粉發(fā)育中的功能鑒定[D]. 馬智明.浙江大學(xué) 2016
[8]野生百合高效再生體系建立及愈傷組織增殖調(diào)控研究[D]. 馬怡迪.浙江大學(xué) 2015
[9]麝香百合胚性愈傷誘導(dǎo)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[D]. 張倩.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[10]百合（Lilium）鱗莖薄層胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生植株遺傳穩(wěn)定性鑒定[D]. 陳龍.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013



本文編號：3644978