由尖孢鐮刀菌古巴�；鸵鸬南憬犊菸∈且环N具有毀滅性的土傳維管束病害,目前還沒有一種防治效果理想的化學(xué)藥劑,且化學(xué)防治存在田間藥劑流失嚴(yán)重、危害環(huán)境和人類的健康等問題。因此,培育抗病品種成為十分迫切的替代策略。探討尖孢鐮刀菌的致病相關(guān)基因的功能,可以深入了解尖孢鐮刀菌的致病機(jī)理,有利于抗病育種研究。前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)小種（Foc4）中的過氧化氫酶1 （cat1）基因和細(xì)胞色素c過氧化物酶（CcP）基因受到巴西蕉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),為研究cat1和CcP基因在Foc4侵染香蕉過程中的作用,利用同源重組方法分別敲除Foc4的cat1和CcP基因,并對(duì)敲除子進(jìn)行了回復(fù),而后對(duì)敲除子/回復(fù)子進(jìn)行了表型分析和致病性測(cè)定。結(jié)果如下:1.成功擴(kuò)增Foc4的cat1基因和CcP基因左右側(cè)同源臂,并構(gòu)建了帶GFP （綠色熒光蛋白）標(biāo)記的敲除載體。2.利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,對(duì)Foc4菌株進(jìn)行了基因敲除,獲得帶有綠色熒光蛋白和潮霉素B雙標(biāo)記的cat1基因缺失突變體和CcP基因缺失突變體。通過融合PCR方法構(gòu)建對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化片段,轉(zhuǎn)化敲除子,得到帶有G418抗性的cat1基因回復(fù)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 導(dǎo)論
    1.1 尖孢鐮刀菌
        1.1.1 尖孢鐮刀菌簡(jiǎn)介
        1.1.2 尖孢鐮刀菌致病機(jī)理
    1.2 香蕉枯萎病
        1.2.1 香蕉枯萎病的發(fā)生與危害
        1.2.2 香蕉枯萎病的發(fā)病癥狀
        1.2.3 香蕉枯萎病的防治
    1.3 植物病原真菌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)
        1.3.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)
        1.3.2 過氧化氫酶
        1.3.3 細(xì)胞色素c過氧化物酶
    1.4 融合PCR法構(gòu)建同源重組DNA片段
    1.5 本研究的目的及意義
2. 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑及配方
        2.1.3 培養(yǎng)基及配方
        2.1.4 儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 cat1和CcP全長(zhǎng)基因的克隆
        2.2.2 cat1和CcP基因克隆載體的構(gòu)建
        2.2.3 cat1和CcP基因敲除載體的構(gòu)建
        2.2.4 尖孢鐮刀菌PEG轉(zhuǎn)化
        2.2.5 基因敲除轉(zhuǎn)化子的鑒定
        2.2.6 突變體菌株表型觀察
        2.2.7 致病性測(cè)定
        2.2.8 數(shù)據(jù)處理
        2.2.9 cat1和CcP基因功能回復(fù)驗(yàn)證
3. 結(jié)果與分析
    3.1 全長(zhǎng)基因的克隆
    3.2 克隆載體的構(gòu)建
        3.2.1 同源臂的擴(kuò)增
        3.2.2 克隆載體的酶切鑒定
    3.3 基因敲除載體的構(gòu)建
        3.3.1 cat1-A-pCT74和CcP-B-pCT74載體酶切鑒定
        3.3.2 B-cat1-A-pCT74和A-CcP-B-pCT74載體酶切鑒定
        3.3.3 敲除轉(zhuǎn)化片段的PCR擴(kuò)增
    3.4 原生質(zhì)體的制備
    3.5 敲除轉(zhuǎn)化子的鑒定
        3.5.1 轉(zhuǎn)化子的綠色熒光檢測(cè)
        3.5.2 轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證
    3.6 回復(fù)轉(zhuǎn)化片段的構(gòu)建
        3.6.1 三個(gè)片段的PCR擴(kuò)增
        3.6.2 回復(fù)片段的PCR擴(kuò)增
    3.7 回復(fù)轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
    3.8 敲除子/回復(fù)子的表型分析
        3.8.1 菌落形態(tài)觀察
        3.8.2 玻璃紙穿透實(shí)驗(yàn)
        3.8.3 纖維素利用實(shí)驗(yàn)
        3.8.4 過氧化氫耐受性實(shí)驗(yàn)
        3.8.5 滲透壓脅迫實(shí)驗(yàn)
        3.8.6 細(xì)胞壁選擇性壓力實(shí)驗(yàn)
    3.9 敲除子/回復(fù)子的致病力測(cè)定
        3.9.1 香蕉離體葉片實(shí)驗(yàn)
        3.9.2 香蕉盆栽苗致病力測(cè)定
        3.9.3 病情指數(shù)和發(fā)病率統(tǒng)計(jì)
4. 討論
    4.1 敲除和互補(bǔ)載體的構(gòu)建
    4.2 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
    4.3 轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)鑒定
    4.4 敲除突變體的表型分析
    4.5 敲除突變體致病力的測(cè)定
    4.6 回復(fù)子功能驗(yàn)證
5. 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
基金項(xiàng)目
論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]幾株尖孢鐮刀菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化[J]. 黃東杰,彭明,李春強(qiáng).  熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(01)
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[6]尖鐮孢古巴�；虵ocr4-1701突變體的生物學(xué)表型研究[J]. 蔣艷琴,曾濤,陳漢清,林妃,袁貴祥,郭剛,曾會(huì)才.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2013(03)
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[9]一種載體構(gòu)建的新方法:重組融合PCR法[J]. 鄺翡婷,袁定陽(yáng),李莉,李新奇.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2012(06)
[10]香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種的快速檢測(cè)與鑒定[J]. 李敏慧,余雄濤,王鴻飛,周佳暖,習(xí)平根,姜子德.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(19)

博士論文
[1]幾個(gè)抗氧化脅迫相關(guān)基因在香蕉枯萎病菌致病中的作用研究[D]. 齊興柱.海南大學(xué) 2013

碩士論文
[1]絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[D]. 周慶新.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



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