典型的漆酶通常屬于輔助活性酶第一家族第一亞族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,簡稱AA1₁家族）,而AA1₂家族的多銅氧化酶通常擁有將二價鐵氧化成三價鐵的活性,部分AA1₂家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因組只有一個AA1₂家族酶基因,該基因編碼的酶蛋白是否擁有漆酶功能尚未清楚。本研究主要從酶生化特性的角度,結合酶基因的表達規(guī)律,對該基因的功能進行初探。對該AA1₂家族基因在梯棱羊肚菌生長發(fā)育不同階段的表達水平進行實時定量PCR檢測;將該基因編碼序列克隆到表達載體中在大腸桿菌中異源表達,層析獲得純化的酶蛋白,對酶蛋白的生化特性進行了鑒定。發(fā)現(xiàn)該AA1₂多銅氧化酶基因在外源營養(yǎng)袋和土壤中的營養(yǎng)菌絲里低表達,在菇原基和子實體中表達較活躍。異源表達獲得純化的酶蛋白分子量約64k Da,表現(xiàn)出亞鐵氧化酶（EC1.16.3.1）與漆酶（EC1.10.3.2）雙重活性。其亞鐵氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6... 

【文章來源】：菌物學報. 2020,39(06)北大核心CSCD

【文章頁數】：13 頁

【部分圖文】：

MiFOX基因與其他已知屬于AA1＿2家族的酶基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹

利用熒光實時定量PCR方法對MiFOX在梯棱羊肚菌不同生長階段的表達量進行相對定量和對比。結果顯示，MiFOX基因在放置營養(yǎng)袋之前、放置營養(yǎng)袋之后和臨近菇原基形成前的土壤菌絲中，以及營養(yǎng)袋菌絲中的相對表達量都較低，在菇原基和子實體中的相對表達量較高。在子實體階段，菌柄與菌蓋中的相對表達量接近。說明MiFOX可能在子實體形成和生長發(fā)育階段起主要作用，而在攝取土壤和營養(yǎng)袋中養(yǎng)分的階段的作用相對較�。▓D3）。2.3 大腸桿菌異源表達MiFOX酶蛋白的活性鑒定

MiFOX基因長度2 011bp，共有5個外顯子、4個內含子（圖1A）。由于MiFOX基因所屬的梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株全基因組進行基因注釋時是利用對應的cDNA標定外顯子區(qū)域，因此外顯子和內含子的起止位置是真實的。編碼的蛋白序列長575個氨基酸，N端帶有18個氨基酸的信號肽，該基因編碼的蛋白可能是分泌型蛋白。生物信息學預測其分子量為63.6kDa，等電點為4.67。3D結構模型預測軟件I-TASSER為MiFOX酶蛋白尋找到的最高相似度模板是啤酒酵母的AA1＿2家族多銅氧化酶Fet3p(PDB登錄號1ZPU），有90%的區(qū)段比對上，比對上的區(qū)域中氨基酸序列相似度49%。預測的3D結構模型為不規(guī)則筒狀，大體上呈三輻射形，有3對β-片層構成三葉螺旋槳形（圖1B）。每對β-片層構成一個槳葉，相互貼近略呈平行夾板狀。在3對β-片層中，中段和C端的兩對β-片層較為典型，而N端的一對β-片層較不規(guī)整。3對β-片層之間由多個α-螺旋和不規(guī)則卷曲串起來。將MiFOX基因與其他已知的屬于AA1＿2家族的酶基因進行氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。CAZy主頁上至2020年2月15日為止已公布的389個被分類為AA1＿2家族的酶基因（http://www.cazy.org/AA1＿2＿all.html），均屬于真核生物。剔除重復和無效序列后，得到382個有效的AA1＿2家族酶基因序列，加上梯棱羊肚菌另一菌株CCBAS932中的1個AA1＿2家族同源基因（GenBank登錄號RPB13240），共384個AA1＿2家族的酶基因，將氨基酸序列進行比對后，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）。梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株中的MiFOX（圖2黑色箭頭示）與CCBAS932菌株中的對應同源基因（圖2空心箭頭示）氨基酸序列和長度都完全相同，與其他絲狀真菌如各種曲霉、鐮刀菌等的AA1＿2家族酶基因在系統(tǒng)進化關系上相對較近，與大多數酵母中的AA1＿2家族酶基因在系統(tǒng)進化關系上相對較遠�？傮w而言，同一個物種不同菌株的AA1＿2家族基因在氨基酸序列上高度相似或完全相同，僅在不同物種之間表現(xiàn)出相對較大的差異，說明AA1＿2酶基因是一個進化上較為保守的基因。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]漆酶在斑玉蕈菌絲生長和子實體發(fā)育中的功能研究[D]. 張津京.南京農業(yè)大學 2014



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