乙醛脫氫酶通過(guò)參與生物體內(nèi)乙醛的代謝過(guò)程,從而減輕乙醛對(duì)細(xì)胞的毒害作用。目前,尚未見(jiàn)有關(guān)糙皮側(cè)耳乙醛脫氫酶基因的報(bào)道。本研究首次對(duì)糙皮側(cè)耳的乙醛脫氫酶基因poaldh1進(jìn)行了克隆和功能分析,旨在從抗逆境脅迫的角度來(lái)揭示糙皮側(cè)耳原基形成的機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)糙皮側(cè)耳雙核菌絲期和原基期進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,獲得了一個(gè)可能編碼乙醛脫氫酶的基因,并將其命名為poaldh1。首先,本文通過(guò)將前期獲得的poaldh1基因的EST標(biāo)簽與糙皮側(cè)耳PC15菌株的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)分析,獲得了poaldh1基因的編碼區(qū)序列。然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法,克隆得到了糙皮側(cè)耳新831菌株的乙醛脫氫酶基因poaldh1,并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序和初步的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,該基因長(zhǎng)度為2,016 bp,編碼序列長(zhǎng)度為1,437 bp,編碼478個(gè)氨基酸。該基因編碼的氨基酸序列具有乙醛脫氫酶中高度保守的10肽序列、催化結(jié)構(gòu)域及谷氨酸活性位點(diǎn)等保守區(qū)域。通過(guò)蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)和GO分析表明,POALDH1是一種NAD（P）⁺依賴型的乙醛脫氫酶。利用半定量PCR（SqRT-PCR）對(duì)poal... 

【文章來(lái)源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 食用菌中差異表達(dá)基因的研究
        1.1.1 食用菌中差異表達(dá)基因的研究現(xiàn)狀
        1.1.2 糙皮側(cè)耳中差異表達(dá)基因的研究現(xiàn)狀
    1.2 乙醛脫氫酶的概況
        1.2.1 乙醛脫氫酶的分類
        1.2.2 乙醛脫氫酶的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 乙醛脫氫酶的催化機(jī)制
        1.2.4 乙醛脫氫酶的生理功能研究
        1.2.5 植物中乙醛脫氫酶的生理功能研究
        1.2.6 動(dòng)物中乙醛脫氫酶的生理功能研究
        1.2.7 細(xì)菌中乙醛脫氫酶的生理功能研究
        1.2.8 真菌中乙醛脫氫酶的生理功能研究
    1.3 乙醛脫氫酶在生物抗非生物脅迫中的研究進(jìn)展
        1.3.1 非生物脅迫及其影響
        1.3.2 乙醛脫氫酶對(duì)非生物脅迫耐受性的影響研究
2 引言
    2.1 研究依據(jù)及意義
    2.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
3 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1.1 菌株和質(zhì)粒
            3.1.1.2 培養(yǎng)基
            3.1.1.3 主要試劑
            3.1.1.4 主要儀器
        3.1.2 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的克隆
            3.1.2.1 引物設(shè)計(jì)
            3.1.2.2 糙皮側(cè)耳原基總RNA的提取
            3.1.2.3 cDNA第一條鏈的合成
            3.1.2.4 糙皮側(cè)耳基因組DNA的提取
            3.1.2.5 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的克隆
            3.1.2.6 PCR產(chǎn)物膠回收純化
            3.1.2.7 PCR回收產(chǎn)物與p MD19–T載體連接
            3.1.2.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            3.1.2.9 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定
        3.1.3 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因生物信息學(xué)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的克隆
        3.2.2 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因生物信息學(xué)分析
    3.3 本章小結(jié)
4 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的差異表達(dá)研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            4.1.1.1 菌株
            4.1.1.2 培養(yǎng)基
            4.1.1.3 主要試劑
            4.1.1.4 主要儀器
        4.1.2 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因表達(dá)模式分析
            4.1.2.1 糙皮側(cè)耳總RNA的提取
            4.1.2.2 cDNA第一條鏈的合成
            4.1.2.3 半定量RT-PCR
        4.1.3 糙皮側(cè)耳原基形成相關(guān)環(huán)境壓力下poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
            4.1.3.1 糙皮側(cè)耳原基形成相關(guān)環(huán)境壓力
            4.1.3.2 半定量RT-PCR
        4.1.4 非生物脅迫下糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
            4.1.4.1 設(shè)置非生物脅迫條件
            4.1.4.2 糙皮側(cè)耳菌絲長(zhǎng)速及長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定
            4.1.4.3 半定量RT-PCR
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因表達(dá)模式分析結(jié)果
        4.2.2 糙皮側(cè)耳原基形成相關(guān)環(huán)境壓力下poaldh1 基因的差異表達(dá)分析結(jié)果
            4.2.2.1 光照刺激下糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
            4.2.2.2 溫差刺激下糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
        4.2.3 非生物脅迫下糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的差異表達(dá)分析結(jié)果
            4.2.3.1 鹽脅迫下糙皮側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng)及poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
            4.2.3.2 干旱脅迫下糙皮側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng)及poaldh1 基因的差異表達(dá)分析
    4.3 本章小結(jié)
5 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因的原核表達(dá)研究
    5.1 材料和方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            5.1.1.1 質(zhì)粒
            5.1.1.2 培養(yǎng)基
            5.1.1.3 主要試劑
            5.1.1.4 主要儀器
            5.1.1.5 主要溶液
        5.1.2 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            5.1.2.1 帶有酶切位點(diǎn)poaldh1 片段的PCR擴(kuò)增
            5.1.2.2 poaldh1 基因的PCR產(chǎn)物回收純化
            5.1.2.3 poaldh1 片段與p ET22b(+)-P_(tac)表達(dá)載體連接
            5.1.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            5.1.2.5 重組質(zhì)粒的提取和鑒定
        5.1.3 poaldh1 基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
            5.1.3.1 poaldh1 基因的誘導(dǎo)表達(dá)
            5.1.3.2 SDS-PAGE分析
        5.1.4 粗酶液中乙醛脫氫酶酶活的測(cè)定
            5.1.4.1 粗酶液蛋白濃度的測(cè)定
            5.1.4.2 粗酶液中乙醛脫氫酶酶活的測(cè)定
        5.1.5 重組菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性測(cè)定
            5.1.5.1 乙醛濃度梯度的設(shè)置
            5.1.5.2 菌種活化
            5.1.5.3 不同濃度乙醛下菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.2 poaldh1 基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
        5.2.3 粗酶液中乙醛脫氫酶酶活的測(cè)定
            5.2.3.1 粗酶液蛋白濃度測(cè)定
            5.2.3.2 粗酶液乙醛脫氫酶酶活的測(cè)定
        5.2.4 重組菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性測(cè)定結(jié)果
    5.3 本章小結(jié)
6 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因過(guò)表達(dá)載體和反義沉默載體的構(gòu)建
    6.1 材料和方法
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            6.1.1.1 質(zhì)粒
            6.1.1.2 培養(yǎng)基
            6.1.1.3 主要試劑
            6.1.1.4 主要儀器
        6.1.2 真核表達(dá)載體pCAMBIA1300 的改造
            6.1.2.1 糙皮側(cè)耳gpd啟動(dòng)子的克隆
            6.1.2.2 克隆帶有酶切位點(diǎn)的gpd啟動(dòng)子及hph片段
            6.1.2.3 真核表達(dá)載體pCAMBIA1300 的改造
        6.1.3 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因過(guò)表達(dá)與反義沉默載體的構(gòu)建
            6.1.3.1 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因過(guò)表達(dá)與反義沉默片段的克隆
            6.1.3.2 糙皮側(cè)耳poaldh1基因過(guò)表達(dá)和反義沉默片段與pPo-GPD連接
            6.1.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            6.1.3.4 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因過(guò)表達(dá)與反義沉默載體的篩選與鑒定
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 糙皮側(cè)耳gpd啟動(dòng)子的克隆
        6.2.2 真核表達(dá)載體pCAMBIA1300 的改造
        6.2.3 糙皮側(cè)耳poaldh1 基因過(guò)表達(dá)與反義沉默載體的構(gòu)建
    6.3 本章小結(jié)
7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化糙皮側(cè)耳
    7.1 材料和方法
        7.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            7.1.1.1 菌株和質(zhì)粒
            7.1.1.2 培養(yǎng)基
            7.1.1.3 主要試劑
            7.1.1.4 主要儀器
        7.1.2 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA
            7.1.2.1 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA
            7.1.2.2 農(nóng)桿菌菌液PCR驗(yàn)證
        7.1.3 糙皮側(cè)耳潮霉素篩選濃度的確定
        7.1.4 糙皮側(cè)耳菌絲球的培養(yǎng)
        7.1.5 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
        7.1.6 農(nóng)桿菌與糙皮側(cè)耳菌絲球共培養(yǎng)
        7.1.7 糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)化子的初篩與復(fù)篩
    7.2 結(jié)果與分析
        7.2.1 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA
        7.2.2 糙皮側(cè)耳潮霉素篩選濃度
    7.3 本章小結(jié)
8 結(jié)論與討論
    8.1 主要結(jié)論
    8.2 討論
    8.3 后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)想
參考文獻(xiàn)
英文摘要


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]逆境脅迫下苜蓿乙醛脫氫酶基因的表達(dá)[J]. 許文花,文亦芾,馬向麗,羅富成,任健.  草原與草坪. 2014(04)
[3]ALDH1A1基因表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用[J]. 吳愛(ài)兵,鄧旭斌,楊志雄,沈湘,李姝君,黎明春,吳昆鵬.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué). 2014(02)
[4]醛脫氫酶超家族研究進(jìn)展[J]. 李彩霞,吳朝霞,王立順.  上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2013(06)
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博士論文
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碩士論文
[1]深海環(huán)境中乙醛降解菌及醛脫氫酶基因的多樣性研究[D]. 商謝謝.廈門大學(xué) 2014
[2]非生物脅迫下棉花植物同源結(jié)構(gòu)域（PHD）轉(zhuǎn)錄因子的研究[D]. 楊雷.石河子大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3619003