葡萄是世界上最重要的果樹樹種之一。目前全球廣泛栽培的葡萄為歐亞種葡萄（Vitis vinifera L.）,品質(zhì)優(yōu)良,但抗寒性差,其生長發(fā)育受到低溫的嚴重影響。中國是葡萄屬植物的起源中心之一,野生葡萄資源豐富多樣,其中山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄屬中最抗寒的種,可耐-40℃的低溫,是十分重要的抗寒基因資源。發(fā)掘山葡萄抗寒相關(guān)基因并研究其功能,對弄清其抗寒分子機制及利用分子手段提高歐亞種葡萄的抗寒性具有重要意義。前期本課題組通過寒脅迫構(gòu)建了中國野生山葡萄抗寒基因的c DNA文庫,獲得了VaERD15基因的EST序列;隨后克隆了VaERD15基因,并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中,證實過表達VaERD15能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性。在此基礎(chǔ)上,本研究從抗寒的中國野生山葡萄‘雙優(yōu)’（V.amurensis acc.Shuangyou）中克隆VaERD15基因全長,分析該基因的功能;進一步從山葡萄‘雙優(yōu)’和歐亞種葡萄‘紅地球’（V.vinifera cv.Red Globe）中克隆ERD15基因CDS上游的999 bp啟動子及其缺失片段,分析啟動子的順式作用元件,并對啟動子及其... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

中國野生山葡萄‘雙優(yōu)’VaERD15基因的克隆M：DNAMarker；1-3：VaERD15

第二章VaERD15序列與功能分析112.3結(jié)果與序列分析2.3.1VaERD15基因克隆與序列分析以‘雙優(yōu)’cDNA為模板進行PCR擴增（圖2-1），將電泳產(chǎn)物回收后，連接到pMD19-T載體上進行測序，獲得CDS為507bp的VaERD15。序列分析表明，VaERD15編碼169個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為23.407kD，理論等電點為5.18，與歐亞種葡萄‘紅地球’中的VvERD15同源性為99%，僅有1個堿基發(fā)生突變（圖2-2）。對VaERD15結(jié)構(gòu)域分析表明，VaERD15含有1個PAM2結(jié)構(gòu)域（圖2-3）。圖2-1中國野生山葡萄‘雙優(yōu)’VaERD15基因的克隆M：DNAMarker；1-3：VaERD15Fig.2-1CloningofVaERD15fromV.amurensisacc.ShuangyouLaneM:DNAMarker;Lane1-3:VaERD15圖2-2VvERD15和VaERD15序列比對Fig.2-2SequenceanalysisofVvERD15andVaERD15VvERD15VaERD15

西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文12圖2-3VaERD15結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-3DomainanalysisofVaERD152.3.2VaERD15亞細胞定位將融合表達載體35S::VaERD15-GFP轉(zhuǎn)入模式植物本氏煙草葉片進行亞細胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在激發(fā)場和融合場中轉(zhuǎn)35S-VaERD15-GFP的熒光信號能夠在細胞核和細胞膜中檢測到，而對照的熒光信號在整個細胞中均能被檢測到，表明VaERD15定位于細胞核和細胞膜中（圖2-4）。圖2-4VaERD15亞細胞定位Fig.2-4SubcellularlocalizationofVaERD152.3.3VaERD15對低溫處理的響應用qRT-PCR分析4℃處理下ERD15在‘紅地球’和‘雙優(yōu)’中的表達模式，結(jié)果顯示‘雙優(yōu)’和‘紅地球’中ERD15的表達模式差異明顯�！t地球’中ERD15受低溫誘導表達量先上調(diào)再下調(diào)，‘雙優(yōu)’中ERD15受低溫誘導在3h表達量劇增達到峰值后先下調(diào)再上調(diào)后下調(diào)，且在低溫處理3h時，ERD15在‘雙優(yōu)’中的表達量是‘紅地球’中的20.3倍。這表明，ERD15在冷脅迫下被誘導表達，在‘紅地球’和‘雙優(yōu)’中表達量和表達模式有明顯差別，推測VaERD15在山葡萄抗寒過程中發(fā)揮重要作用（圖2-5）。MergedUVlightChloroplastBrightlightauto-fluorescence35S::GFP35S::VaERD15-GFP

【參考文獻】：
期刊論文
[1]6個石榴品種抗寒性評價及方法篩選[J]. 劉貝貝,陳利娜,牛娟,李好先,張杰,曹尚銀.  果樹學報. 2018(01)
[2]低溫脅迫對不同百合主要生理指標的影響[J]. 王玲麗,賈文杰,馬璐琳,崔光芬,吳麗芳,王祥寧,段青,蔣亞蓮,王繼華.  植物生理學報. 2014(09)
[3]玉米大斑病菌聚酮體合成酶基因StPKS功能分析[J]. 張鑫,曹志艷,劉士偉,郭麗媛,董金皋.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2011(08)
[4]葡萄抗寒性生理指標篩選及其評價[J]. 曹建東,陳佰鴻,王利軍,毛娟,趙鑫.  西北植物學報. 2010(11)
[5]擬南芥脫水誘導早期應答基因研究進展[J]. 劉穎慧,王天宇,黎裕.  中國農(nóng)業(yè)大學學報. 2009(03)
[6]果梅種質(zhì)枝條抗寒性鑒定[J]. 高志紅,章鎮(zhèn),韓振海.  果樹學報. 2005(06)
[7]葡萄總RNA提取方法的研究[J]. 張今今,王躍進,王西平,楊克強,楊進孝.  果樹學報. 2003(03)
[8]在低溫鍛煉中毛白楊幼苗可溶性總蛋白、RNA、DNA、RNase及抗凍性的變化（英文）[J]. 林善枝,張志毅.  Forestry Studies in China. 2002(02)
[9]我國葡萄屬野生種抗寒性的研究[J]. 賀普超,牛立新.  園藝學報. 1989(02)
[10]我國葡萄屬野生種質(zhì)資源的抗寒性分析[J]. 賀普超,晁無疾.  園藝學報. 1982(03)

碩士論文
[1]葡萄VvABCG20基因啟動子的克隆及活性分析[D]. 史圓圓.西北農(nóng)林科技大學 2017
[2]中國野生山葡萄VaERD15基因的功能驗證[D]. 于冬冬.西北農(nóng)林科技大學 2016



本文編號：3540476