黃瓜作為最有經(jīng)濟價值作物之一,在全球已經(jīng)被廣泛種植。然而,由灰葡萄孢菌引起的黃瓜灰霉病對黃瓜種植造成了嚴重的經(jīng)濟損失。除侵染黃瓜外,灰葡萄孢菌還可以侵染逾二百種植物�；谶@個原因,我們展開了如下幾個研究：（一）構(gòu)建一個灰霉病的PMA-qPCR檢測方法：（1）選用灰葡萄孢菌的P729基因為定量檢測的靶基因,并以P729基因為目的基因構(gòu)建克隆載體（2）設(shè)計定量引物并驗證特異性,將克隆載體導入感受態(tài)細胞后擴繁培養(yǎng),提取質(zhì)粒作為標準品,根據(jù)其濃度將其稀釋為5×100—5×106七個梯度繪制標準曲線（3）將構(gòu)建好的方法用于患病葉片的檢測,證明該方法可以快速準確的檢測灰葡萄孢菌,為農(nóng)業(yè)上的灰霉病的監(jiān)測提供了有效的手段。（二）隨著Hi-seq技術(shù)的出現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄組水平上研究植物-病原體互作也變得可能。據(jù)我們所知,本研究是第一次將轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用到黃瓜-灰葡萄孢菌互作來研究二者互作后基因表達的差異�？偣�,我們得到了248,908,688個原始序列,當去掉低質(zhì)量,帶接頭和含有不確定堿基的序列后我們得到了238,341,648個高質(zhì)量的序列,隨后我們將這些序列分別比對到黃瓜和灰葡萄孢菌的參考基因組上。根據(jù)表達... 

【文章來源】：北京林業(yè)大學北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 黃瓜灰霉病及其病原菌
        1.1.1 灰霉病的危害與防治
        1.1.2 灰葡萄孢的致病機制
            1.1.2.1 侵入宿主表面
            1.1.2.2 侵入細胞壁殺死宿主細胞
            1.1.2.3 毒素
            1.1.2.4 草酸
            1.1.2.5 活性氧
            1.1.2.6 轉(zhuǎn)化宿主組織
            1.1.2.7 酶類
            1.1.2.8 克服宿主的防御反應(yīng)
    1.2 植物抵抗病原體的機制
        1.2.1 模式觸發(fā)的免疫PTI
        1.2.2 觸發(fā)的免疫效應(yīng)ETI
    1.3 轉(zhuǎn)錄組測序研究植物病原體互作
        1.3.1 宿主或病原體轉(zhuǎn)錄組研究的發(fā)展
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢
        1.3.3 病原體的轉(zhuǎn)錄組測序
        1.3.4 宿主的轉(zhuǎn)錄組測序
    1.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控對植物病原體互作的影響
    1.5 本研究的目的和意義
2 黃瓜灰霉病PMA-qPCR診斷方法構(gòu)建
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 主要試劑及設(shè)備
        2.1.3 試驗方法
            2.1.3.1 灰葡萄孢菌P729特異基因的擴增
            2.1.3.2 目的條帶的回收與純化
            2.1.3.3 回收條帶測序鑒定
            2.1.3.4 熒光定量PCR引物設(shè)計和特異性驗證
            2.1.3.5 標準品的構(gòu)建
            2.1.3.6 Real—time PCR標準曲線的建立
            2.1.3.7 實際樣本的檢測
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 灰葡萄孢菌P729基因的擴增
        2.2.2 熒光定量引物的特異性驗證
        2.2.3 標準曲線的構(gòu)建
        2.2.4 重復性分析
        2.2.5 實際樣品的檢測
    2.3 小結(jié)與討論
3 黃瓜與灰葡萄孢菌互作轉(zhuǎn)錄組學分析
    3.1 實驗材料與方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要試劑和設(shè)備
        3.1.3 黃瓜的培養(yǎng)和侵染
            3.1.3.1 黃瓜種子的消毒
            3.1.3.2 黃瓜的培養(yǎng)和侵染
        3.1.4 RNA的提取
        3.1.5 總RNA的質(zhì)量檢測
        3.1.6 文庫的構(gòu)建及上機檢測
        3.1.7 數(shù)據(jù)分析
            3.1.7.1 測序質(zhì)量評估
            3.1.7.2 數(shù)據(jù)過濾
            3.1.7.3 序列比對到參考基因組
            3.1.7.4 基因表達水平分析和差異表達分析
            3.1.7.5 差異基因的GO富集分析和KEGG富集分析
        3.1.8 差異基因定量驗證
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 測序數(shù)據(jù)過濾
        3.2.2 將序列比對到參考基因組
        3.2.3 差異基因分析
        3.2.4 植物和病原體的差異基因的GO富集分析
            3.2.4.1 黃瓜GO富集分析
            3.2.4.2 灰葡萄孢菌的GO富集分析
        3.2.5 植物和病原體的KEGG富集分析
            3.2.5.1 黃瓜的差異基因的KEGG富集分析
            3.2.5.2 灰葡萄孢菌的差異基因的KEGG富集分析
        3.2.6 差異基因的qPCR驗證
    3.3 小結(jié)與討論
4 定量模型分析轉(zhuǎn)錄調(diào)控驅(qū)動黃瓜-灰葡萄孢菌互作
    4.1. 方法
        4.1.1 基于似然的混合模型
        4.1.2 通過EM算法估計
        4.1.3 實際數(shù)據(jù)
        4.1.4 假設(shè)檢驗
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 聚類分組
        4.2.2 富集結(jié)果分析
    4.3 討論
5 結(jié)論
參考文獻
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導師簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]PMA-qPCR方法用于監(jiān)測超聲波滅菌效率的適用性及其應(yīng)用[J]. 李聰聰,余以剛,邱楊,肖性龍,郭毅岱.  現(xiàn)代食品科技. 2012(04)
[2]源自不同寄主的灰葡萄孢生物學特性的比較研究[J]. 高智謀,李艷梅,李喜玲,章戰(zhàn)華,營金鳳.  菌物學報. 2009(03)



本文編號：3530186