美國山核桃（Carya illinoinensis）是世界上著名經(jīng)濟林樹種之一。本研究以美國山核桃生長季方塊芽接不同發(fā)育時期的嫁接口為材料,探索美國山核桃蛋白的最優(yōu)提取方法,并建立適用、高效的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)體系,構(gòu)建嫁接口不同發(fā)育時期的蛋白表達圖譜,篩選與嫁接成活相關(guān)的差異蛋白,并進行質(zhì)譜鑒定,對鑒定成功的蛋白質(zhì)通過數(shù)據(jù)庫檢索進行功能分析及歸類,旨在為揭示美國山核桃芽接嫁接口愈合機理提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1.建立了適合于美國山核桃總蛋白提取的最優(yōu)方法和雙向電泳體系。以Tris-HCL浸提法進行蛋白質(zhì)的提取,以p H4⁷的IPG膠條、上樣量260μg進行雙向電泳,效果最佳。2.對美國山核桃嫁接愈合過程10個不同發(fā)育時期的蛋白質(zhì)2-DE圖譜進行分析,隨著美國山核桃嫁接口的發(fā)育,各時期分離的總蛋白點數(shù)總體呈先上升后降低再上升的變化趨勢。不同階段蛋白質(zhì)點數(shù)差異較大的時期是嫁接后第0³d之間、嫁接后第10¹5d之間、嫁接后第20³0d之間。各時期差異達5倍以上的蛋白質(zhì)點共138個,... 

【文章來源】：南京林業(yè)大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

種蛋白提取方法雙向電泳圖譜比較

的雙向電泳圖譜。經(jīng) Image Master TM 2D 軟件分析不同 pH 范圍雙向電泳圖譜蛋白點分布數(shù)據(jù)，pH3～10 雙向電泳圖譜共檢測到蛋白點 853 個，其中 pH4～7 內(nèi)蛋白點分布較多，約 759 個，占蛋白質(zhì)點總數(shù)的 89%，而 pH3～4 和 pH7～10 內(nèi)的蛋白質(zhì)點分布較少，分別為 44 和 50 個，占蛋白質(zhì)點總數(shù)的 11%，從圖可看出蛋白質(zhì)點大多數(shù)分布在圖譜的酸性端，堿性端分布的蛋白點較少。pH4～7 雙向電泳圖譜共檢測到蛋白點數(shù) 1102 個，明顯多于 pH3～10 圖譜中的蛋白點數(shù)量，由此可知使用不同 pH 范圍膠條可提高特定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)點的分辨率。此外，膠條 pH 范圍在 3～10 時，在 pH4～6 間的中、高分子量蛋白質(zhì)點非常鄰近，彼此之間排列過于緊密甚至重疊在一起，無法得到有效的分離，影響后期的圖像分析和特異蛋白的切取，而 pH4～7 圖譜中，蛋白質(zhì)得到了有效的分離，蛋白點清晰可見。綜上可知，采用 24cm，pH4～7 的 IPG 膠條，雙向電泳分離效果最佳，更適合美國山核桃嫁接莖段蛋白質(zhì)的雙向電泳。IEFIEFpH310ABpH47

圖 4 不同蛋白上樣量雙向電泳圖譜比較Fig.4 Comparison on 2-DE gel maps of different protein loading注：圖譜 A 和 B 分別對應(yīng)蛋白上樣量為 240μg 和 260μg。4.2 嫁接口不同發(fā)育時期的蛋白質(zhì)差異表達譜分析4.2.1 嫁接口不同發(fā)育時期總蛋白點數(shù)目的變化情況采用 Tris-HCL 浸提法提取蛋白，使用 24cm、pH4～7 IPG 干膠條和 13% SDS-PAGE膠，上樣量 260μg/gel，通過嚴格一致的雙向電泳程序，對美國山核桃嫁接愈合過程 10 個不同發(fā)育時期（實生 CK、嫁接后第 1、3、6、8、10、15、20、25 和 30 天）的嫁接口蛋白質(zhì)進行了 IEF-SDS-PAGE 分離，經(jīng)銀染后，獲得了分辨率和重復性較好的 2-DE 圖譜（見圖 5），并采用 Image Master TM 2D Platinum Software7.0 軟件對 10 個發(fā)育時期的 2-DE 圖譜進行分析。結(jié)果表明，隨著美國山核桃嫁接口的發(fā)育，各時期分離的總蛋白點數(shù)總體呈現(xiàn)先上升后降低再上升的變化趨勢。在未嫁接實生對照的蛋白質(zhì)圖譜上檢測到分離的蛋白質(zhì)點數(shù)約 1852 個，而嫁接后第 1 天檢測到的蛋白點數(shù)目最多為 2566 個，其次在嫁接后第 30 天的蛋白質(zhì)圖譜上檢測到分離的蛋白質(zhì)點數(shù)為 2261 個。在嫁接后第 3、10 天的

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]荔枝果實成熟過程中的差異蛋白質(zhì)組學研究[D]. 李開拓.福建農(nóng)林大學 2011

碩士論文
[1]CcARF基因在山核桃嫁接過程中的功能分析[D]. 方佳.浙江農(nóng)林大學 2013
[2]嫁接引起茄科植物可遺傳的DNA甲基化模式變異及其可能機制的研究[D]. 吳蕊.東北師范大學 2009
[3]山核桃嫁接成活相關(guān)基因克隆[D]. 褚懷亮.浙江林學院 2008



本文編號：3499291