番茄（Solanum lycopersicum L.）是目前世界上栽培最廣泛的蔬菜之一,因其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富而深受人們喜愛�；ǚ郯l(fā)育對于開花植物的有性繁殖來說至關(guān)重要�；ǚ鄣拿劝l(fā)和花粉管的伸長是植物完成雙受精的前提。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛參與了植物的生長發(fā)育、非生物脅迫應(yīng)答、激素調(diào)控以及次生代謝物質(zhì)的合成等。但在番茄中MYB轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控花粉發(fā)育還不清楚。之前的研究報道,番茄R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYB64響應(yīng)低溫、鹽等非生物脅迫。為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因成功轉(zhuǎn)入番茄矮生品種Micro-Tom中,得到7個T1代過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系,但沒有得到可育的種子。通過比較野生型和過表達(dá)株系的花粉活力、花粉萌發(fā)率及花粉粒外部形態(tài),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SlMYB64顯著降低了花粉的活力和花粉萌發(fā)率;而且轉(zhuǎn)基因株系的花粉萌發(fā)孔發(fā)育不正常。為了得到可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系,又將其轉(zhuǎn)入另一番茄材料“黃果自交系”中,獲得17個T1代轉(zhuǎn)基因株系。選取了3個表達(dá)水平不同的T2代轉(zhuǎn)基因株系并對其進(jìn)行了花粉育性分析。利用亞歷山大染色法對花粉活力進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn):... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

植物MYB轉(zhuǎn)錄因子分類H：表示螺旋；T：表示轉(zhuǎn)角；W：表示色氨酸；X：表示任意氨基酸

其中本實驗利用基因過表達(dá)技術(shù)研究R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYB64在番茄中的功能，基因的過表達(dá)技術(shù)利用pBI121雙元表達(dá)載體，本實驗用的實驗室改造后的pBI121表達(dá)載體，其中把GUS基因去掉，然后人為的在此位置加了9個多克隆酶切位點如（圖2）。圖 2 插入pBI121載體中的酶切位點片段Fig. 2 The segment of restriction enzyme cutting site which was inserted in the pBI121番茄基因組測序的完成及轉(zhuǎn)基因體系的成熟，為利用反向遺傳學(xué)技術(shù)研究番茄基因的功能奠定了基礎(chǔ)。利用反向遺傳學(xué)研究R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlMYB64在番茄中的功能，以確定SlMYB64在花粉發(fā)育過程中的所起到的作用。

鍍一層金屬膜。3 結(jié)果與分析3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化3.1.1 番茄 SlMYB64 過表達(dá)載體的構(gòu)建將帶BamHI 與 SalI酶切位點的引物所克隆出的目的基因SlMYB64 的 CDS全長連接到 pEASY 克隆載體上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆、搖菌、測序、質(zhì)粒提取、選擇測序正確的質(zhì)粒用BamHI和 SalI兩限制性內(nèi)切酶分別酶切帶目的基因片段的pEASY載體和改造后的 pBI121 表達(dá)載體。跑電泳，膠回收，回收產(chǎn)物并連接、轉(zhuǎn)化、選取陽性克隆、質(zhì)粒提取，然后用 BamHI 與 SalI 兩限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切正確后電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌，選取陽性單克隆，用 35S 序列和基因自身序列作為上下游引物進(jìn)行農(nóng)桿菌菌落 PCR 驗證，結(jié)果如下。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3459608