HD-ZIP Ⅲ類轉(zhuǎn)錄因子是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控多種植物細胞的分化,如分生組織的形成、側生器官極性的建立、維管組織細胞的分化等。到目前為止,大多數(shù)關于HD-ZIP Ⅲ基因的研究都主要集中在擬南芥、水稻和玉米等模式植物上,而在瓜類作物上的相關報道還很少。課題組通過前期基因的精細定位,鑒定了黃瓜卷葉突變體的候選基因為CsPHB（PHABULOSA）。本研究對該基因進行克隆,并構建植物表達載體,運用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化初步驗證該基因的功能。主要結果如下:1. CsPHB基因調(diào)控的黃瓜卷葉突變體表型分析黃瓜卷葉突變體與野生型相比在不同生育期均有明顯差異,突變體純合子的卷葉表型更加明顯,雜合子屬于中間型,說明CsPHB存在劑量效應;幼苗期突變體的主根長和側根數(shù)均顯著高于野生型,而株高、莖粗、葉面積和葉周長與野生型相比無顯著差異,在結果期突變體的株高、莖粗、葉面積、葉周長均低于野生型。2. 黃瓜卷葉突變體結果期的莖組織切片觀察通過組織切片觀察,發(fā)現(xiàn)突變體與野生型莖的基本結構相同,均有9個大小不同的雙韌維管束;統(tǒng)計500um的視野下導管直徑大于50um的導管數(shù)量,發(fā)現(xiàn)突變體的木質(zhì)部導管... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CsPHB的氨基酸序列及miRNA的互補位點G→A代表從野生型CCMC到突變體cul的單堿基突變

第二章試驗材料與方法15圖2-1單靶點sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下劃線序列為敲除載體酶切后形成的粘性末端的互補序列。2.8.1.2載體線性化處理利用限制性核酸內(nèi)切酶BsaI對載體pKSE401-cas9酶切，將載體pKSE401-cas9進行線性化處理，酶切體系為：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，輕搖混合，37℃過夜酶切，65℃保溫20min使酶失活，在酶切體系中加入CIAP去磷酸化處理，防止載體發(fā)生自連，瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。2.8.1.3載體的構建和鑒定將sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR儀中65℃退火合成雙鏈，用無縫克隆試劑盒將線性植物表達載體pKSE401-cas9與雙鏈sgRNA連接，連接產(chǎn)物純化回收轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測并測序鑒定正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。2.8.2雙靶點載體的構建2.8.2.1靶點設計根據(jù)2.8.1.1的方法確定CsPHB基因合適的靶點序列：圖2-2雙靶點序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation

第二章試驗材料與方法15圖2-1單靶點sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下劃線序列為敲除載體酶切后形成的粘性末端的互補序列。2.8.1.2載體線性化處理利用限制性核酸內(nèi)切酶BsaI對載體pKSE401-cas9酶切，將載體pKSE401-cas9進行線性化處理，酶切體系為：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，輕搖混合，37℃過夜酶切，65℃保溫20min使酶失活，在酶切體系中加入CIAP去磷酸化處理，防止載體發(fā)生自連，瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。2.8.1.3載體的構建和鑒定將sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR儀中65℃退火合成雙鏈，用無縫克隆試劑盒將線性植物表達載體pKSE401-cas9與雙鏈sgRNA連接，連接產(chǎn)物純化回收轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測并測序鑒定正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。2.8.2雙靶點載體的構建2.8.2.1靶點設計根據(jù)2.8.1.1的方法確定CsPHB基因合適的靶點序列：圖2-2雙靶點序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation


本文編號：3409197