散種（shattering）是指植物的種子成熟后,種子從植株上脫落的特性。在豆科、禾本科等植物中散種的調(diào)控機(jī)制已有深入研究,而在菊科植物中相關(guān)研究較少,散種調(diào)控機(jī)理還未知。為定位克隆生菜中控制散種性狀的基因,實(shí)驗(yàn)室利用已有的栽培生菜W111（不散種）和野生生菜PI491245（散種）雜交后自交獲得F₂代散種分離群體,該表型分離比符合孟德?tīng)柗蛛x定律（散種:不散≈3:1）。利用該群體定位調(diào)控散種性狀的候選基因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有分離群體,將控制散種性狀的目的基因定位在6號(hào)染色體9.280Mb～17.002Mb之間,約7.72Mb。利用RNA測(cè)序的240份萵苣材料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)合功能注釋,預(yù)測(cè)LG6581050與LG6580947為控制生菜散種性狀的候選基因,它們的功能分別是乙烯相關(guān)因子和多聚半乳糖醛酸酶的。分析候選基因的表達(dá)量,LG6581050在生菜花托和苞片的表達(dá)量高于其他組織,而LG6580947在生菜的不同組織中都有表達(dá)。對(duì)散種近等基因系材料的總苞和花托進(jìn)行了乙烯和細(xì)胞壁成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)乙烯含量在不散種和散種材料中無(wú)明顯差異,而纖維素和果膠在不散種材料中顯著高... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

落粒性基因的調(diào)控解析(茍亞軍等,2019)

生菜散種性狀與葉片紅色深淺的基因定位及遺傳分析5圖2擬南芥離層區(qū)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。紅色箭頭，基因正調(diào)控；黑色虛線箭頭，基因負(fù)調(diào)控；方括號(hào)，多個(gè)基因負(fù)調(diào)控(Vittorietal.,2019)Fig.2TheregulatorynetworkforthedifferentiationoftissuesthatarenecessaryforpoddehiscenceinArabidopsis.Redarrows,positivegeneregulation;blackdashedarrows,negativegeneregulation;squarebrackets,negativeregulationonmorethanonegene(Vittorietal.,2019)1.1.3.5激素對(duì)種子脫落的作用植物激素是植物體內(nèi)的信號(hào)分子，能調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。脫落酸在種子等器官的脫落中起直接作用(Xieetal.,2017)。生長(zhǎng)素含量的高低會(huì)影響種子的落粒性，例如在擬南芥中，瓣膜邊緣分離層中生長(zhǎng)素含量達(dá)到最低限度會(huì)引起IND基因的表達(dá)，促進(jìn)種子的脫落(Sorefanetal.,2009)。SPAT-ULA(SPT)基因是一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，是生殖器官發(fā)育所必需的，IND和SPT參與調(diào)節(jié)瓣膜邊緣生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)，并相互作用調(diào)控離層區(qū)的形成(Girinetal.,2011)。植物激素細(xì)胞分裂素在雌蕊、果實(shí)形態(tài)和形態(tài)建成中起重要作用，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有拮抗作用(Marschmartinezetal.,2012)。研究表明，細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑活躍于瓣膜邊緣，細(xì)胞分裂素對(duì)于瓣膜邊緣細(xì)胞的分化具有重要作用，在shp1/2和ind突變體中，未成熟的果實(shí)的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)瓣膜邊緣細(xì)胞的形成(Klee,2004)，進(jìn)而促進(jìn)果莢的開(kāi)裂。乙烯作為植物激素，可以調(diào)節(jié)花和種子的脫落，乙烯含量的增加通常與組織衰老和細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)。乙烯轉(zhuǎn)錄因子（ETR1、EIN2、EIN3）在離層形成中起作用，能促進(jìn)離層的發(fā)育。此外，乙烯是生長(zhǎng)素的有效抑制劑，乙烯和生長(zhǎng)素之間的平衡和相互作用可能是調(diào)控和決定脫落的關(guān)鍵因素(Xieetal.,2017)。赤霉

生菜散種性狀與葉片紅色深淺的基因定位及遺傳分析111.2.2.10.1超表達(dá)載體構(gòu)建為驗(yàn)證候選基因的功能，構(gòu)建了候選基因的超量表達(dá)載體。擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)，從ATG開(kāi)始到終止密碼子，在正引物的5’端加上接頭序列：CAAGTTCTTCACTGTTGATACATATG，在反向引物的5’端加上接頭序列：CCCGGGGTCGACGGGCATATG，以cDNA為模版進(jìn)行擴(kuò)增，用高保真酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得外源片段。將NdeI酶切后的PRI101-GFP載體（圖3）與外源片段進(jìn)行同源重組（同源重組的方法見(jiàn)附錄2），同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)（北京全式金生物技術(shù)公司），利用Pri101-F/R引物檢測(cè)大腸桿菌菌落，檢測(cè)獲得的陽(yáng)性單克隆，送公司進(jìn)行測(cè)序（武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司），對(duì)序列正確的陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌液保存與質(zhì)粒提取，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101（上海唯地生物技術(shù)有限公司），利用Pri101-F/R引物檢測(cè)農(nóng)桿菌菌落，陽(yáng)性菌落加入50%甘油保存于-80℃。圖3PRI-101-GFP載體示意圖Fig.3PRI-101-GFPVectorsketch1.2.2.10.2CRISPR敲除載體構(gòu)建為進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因的功能，構(gòu)建候選基因敲除載體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，觀察轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗表型。敲除載體構(gòu)建：利用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)建立的gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，將目的基因LG6581050與LG6580947的cDNA序列導(dǎo)入該網(wǎng)址，設(shè)計(jì)gRNA。在gRNA兩頭加上引物接頭，其中以gRNA2反向序列加上相應(yīng)接頭作為反向引物，以質(zhì)粒pCBC-DT1T2為模板使用高保真酶擴(kuò)增目的序列。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小是否正確，將正確的PCR產(chǎn)物與BsaI酶切好的PKSE401載體進(jìn)行同源重組（圖4），同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)（北京全式金生物技術(shù)公司），利用引物

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3295730