番茄是茄科番茄屬植物,作為食用蔬果全球廣泛性種植。番茄病毒病嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量及產(chǎn)品品質(zhì)。其中煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒是番茄10多種主要毒源之首,普遍危害世界各番茄種植區(qū),常以單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染形式危害植株。目前常用的方法是培育抗病品種或繁殖脫毒苗。RNA干涉技術(shù)作為基因工程技術(shù)之一,其應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)逐步展現(xiàn),因其高效特異性、可遺傳性及生物安全性成為備受關(guān)注的抗病育種手段之一。試驗(yàn)依據(jù)RNA干擾機(jī)制構(gòu)建針對TMV和CMV雙靶向的RNA干涉雙元載體系統(tǒng)。方法:以TMV、CMV病毒基因作為RNA干擾靶標(biāo)基因,針對病毒株系間基因同源區(qū)域設(shè)計(jì)靶標(biāo)基因目的序列引物。以復(fù)合感染TMV和CMV病毒的番茄葉片提取植物總RNA。經(jīng)RT-PCR分別獲得TMV和CMV的目的序列c DNA。介助T載體將兩段靶序列連接成一條DNA序列。酶切后依次正向、反向錨定連接到PUCC-RNAi中間載體的克隆位點(diǎn),形成靶序列在載體中的雙向重復(fù)結(jié)構(gòu);酶切后插入到p C2300-35S-OCS表達(dá)載體中,重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,完成RNAi雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。選取無菌番茄幼苗的葉片和下胚軸為外植體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵... 

【文章來源】：牡丹江師范學(xué)院黑龍江省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
第1章 引言
    1.1 番茄病毒病害概述
    1.2 番茄病毒病害防治的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 常規(guī)方法防治番茄病毒病原的研究進(jìn)展
        1.2.2 分子生物學(xué)技術(shù)在番茄病毒病害防治中的應(yīng)用
    1.3 課題的研究內(nèi)容及研究目的和意義
        1.3.1 主要研究內(nèi)容
        1.3.2 項(xiàng)目研究的目的和意義
第2章 RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因番茄的培育
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法
        2.2.1 RNAi靶標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)及目的序列片段克隆
        2.2.2 TMV和CMV目的序列的融合連接
        2.2.3 RNAi載體構(gòu)建
        2.2.4 RNAi雙元載體系統(tǒng)構(gòu)建
        2.2.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源RNAi載體對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.6 RNAi轉(zhuǎn)基因番茄的抗性鑒定
第3章 結(jié)果與分析
    3.0 番茄病毒病源驗(yàn)證
    3.1 靶基因目的序列的克隆及RNAi雙元載體構(gòu)建
    3.2 篩選的轉(zhuǎn)化番茄PCR檢測及病毒抗性鑒定
    3.3 轉(zhuǎn)基因番茄內(nèi)非RNAi靶標(biāo)基因熒光定量PCR驗(yàn)證
第4章 討論
    4.1 農(nóng)桿菌侵染番茄過程中影響外源基因轉(zhuǎn)化的因素
    4.2 繼代培養(yǎng)中選擇壓力對轉(zhuǎn)化率的影響
    4.3 影響轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)抗病能力的因素
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
版圖及版圖說明
附錄( 試劑配方 )
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]TMV和CMV病毒外殼蛋白基因雙靶向的RNA干涉載體構(gòu)建[J]. 尹蕾,唐凱悅,張躍新,李猷,律鳳霞.  湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016(03)
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[3]輪作不同蔬菜對大棚番茄連作基質(zhì)中微生物與酶及后茬番茄的影響[J]. 李威,程智慧,孟煥文,周靜,梁靜,劉雪嬌.  園藝學(xué)報(bào). 2012(01)
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[5]番茄病害的主要發(fā)生原因及綜合防治措施[J]. 章恒毅.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2010(19)
[6]植物病毒病的發(fā)生與防治[J]. 郭萬卓,譚丕和.  吉林蔬菜. 2010(02)
[7]番茄抗病基因分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 吳媛媛,李海濤,張子君,鄒慶道.  貴州農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(02)
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博士論文
[1]基于RNA干擾技術(shù)的加工番茄抗CMV、ToMV的研究[D]. 喬亞紅.石河子大學(xué) 2013
[2]番茄RNA沉默體系的鑒定及其抗病毒新方法的研究[D]. 白描.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]黃瓜花葉病毒基因組表達(dá)與寄主microRNA的相關(guān)性研究[D]. 馮俊麗.浙江大學(xué) 2009
[4]轉(zhuǎn)基因番茄標(biāo)記基因剔除及翻譯起始因子4E基因順化植物的病毒抗性[D]. 張余洋.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006

碩士論文
[1]利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D]. 李猷.牡丹江師范學(xué)院 2015
[2]我國主要煙區(qū)煙草黃瓜花葉病毒的鑒定及全基因組序列分析[D]. 金大偉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]煙草品種對煙草花葉病毒病和黃瓜花葉病毒病的抗病性鑒定研究[D]. 黃婷.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012
[4]番茄黃化曲葉病毒病的防治效果及相關(guān)抗性基因的表達(dá)特征分析[D]. 何鑫.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[5]煙草黃瓜花葉病毒病抗性遺傳分析及其分子標(biāo)記[D]. 范靜苑.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009
[6]番茄四個(gè)抗病基因的基因標(biāo)記的創(chuàng)建與輔助選擇[D]. 孫亞林.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[7]RNA干涉技術(shù)在煙草抗TMV病毒育種中的應(yīng)用[D]. 律鳳霞.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2008
[8]辣椒抗黃瓜花葉病毒（CMV）遺傳分析及ISSR分子標(biāo)記篩選[D]. 吳小麗.揚(yáng)州大學(xué) 2007
[9]煙草花葉病毒病的發(fā)生及化學(xué)防治機(jī)理研究[D]. 呂春霞.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2003



本文編號：3295573