百合是世界著名多年生觀賞花卉,其花枝挺拔、花型優(yōu)美、花香迷人、花色豐富,深受世界人民喜愛(ài),因此在鮮切花市場(chǎng)占有重要地位。雖然百合花色現(xiàn)有粉紅色系、橙色系、白色等顏色,但藍(lán)紫色百合花始終是人們向往的品種�；ㄇ嗨貜V泛分布于植物體內(nèi),可以使植物呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫、淺粉等顏色。其中花青素合成酶（anthocyanidin synthase, ANS,又稱(chēng)leucoanthocyanidin dioxygenase, LDOX）是花青素合成末期的關(guān)鍵酶,它可以將無(wú)色的花青素催化成有色的花青素,并且在大多數(shù)植物的花中特異性表達(dá)。因此研究花青素合成酶基因（ANS）啟動(dòng)子可以為通過(guò)基因工程手段改變花色奠定重要基礎(chǔ)。本研究采用的植物材料是垂花百合花被片,垂花百合是我國(guó)原生種,其花被卷曲呈紫紅色。我們將現(xiàn)有的LcANS基因啟動(dòng)子通過(guò)缺失的方法探究其上順式作用元件的功能。主要結(jié)果如下：1.采用染色體步移法克隆得到垂花百合ANS基因啟動(dòng)子序列,通過(guò)生物信息學(xué)軟件PLACE和PlantCARE等,在線分析ANS基因啟動(dòng)子上的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子含有光響應(yīng)元件BoI、ATCT-motif, AE-box、chs-... 

【文章來(lái)源】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 高等植物啟動(dòng)子概述
        1.1.1 高等植物啟動(dòng)子的概念
        1.1.2 真核植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 啟動(dòng)子的分類(lèi)
    1.2 啟動(dòng)子的功能研究方法
        1.2.1 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
        1.2.2 點(diǎn)突變分析
        1.2.3 酵母單雜交技術(shù)
        1.2.4 染色體免疫共沉淀法
        1.2.5 凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)
        1.2.6 瞬時(shí)表達(dá)分析
        1.2.7 穩(wěn)定表達(dá)分析
        1.2.8 缺失體分析
        1.2.9 常用報(bào)告基因
    1.3 花色相關(guān)基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展
        1.3.1 查爾酮合成酶(CHS)
        1.3.2 查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)
        1.3.3 氫黃酮醇還原酶基因(DFR)
        1.3.4 花青素合成酶(ANS)
        1.3.5 類(lèi)黃酮3’5’羥化酶基因(F3’5’H)
    1.4 研究目的與意義
    1.5 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
第二章 ANS基因啟動(dòng)子的克隆與缺失融合載體的構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與克隆載體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 常用培養(yǎng)基的配置方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 垂花百合基因組DNA的提取及純化
        2.2.2 特異性引物的設(shè)計(jì)
        2.2.3 啟動(dòng)子序列的獲得
        2.2.4 獲得ANS基因啟動(dòng)子缺失片段
        2.2.5 缺失載體的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 垂花百合基因組DNA的提取
        2.3.2 染色體步移法克隆ANS基因啟動(dòng)子
        2.3.3 ANS基因啟動(dòng)子5’端缺失片段的克隆
        2.3.4 pMD18T-ANSpQ(1～5)重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證
        2.3.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測(cè)
    2.4 討論
第三章 LcANSp基因啟動(dòng)子及缺失體在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與質(zhì)粒
        3.1.3 試劑及儀器
    3.2 方法
        3.2.1 農(nóng)桿菌工程菌的構(gòu)建與鑒定
        3.2.2 野生型擬南芥種子對(duì)硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性檢測(cè)
        3.2.3 倒置浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥
        3.2.4 硫酸卡那霉素篩選T_0代種子
        3.2.5 T_0代抗性植株的PCR檢測(cè)
        3.2.6 T_2代抗性植株的獲得
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.3.2 農(nóng)桿菌工程菌的鑒定
        3.3.3 野生型擬南芥對(duì)硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性檢測(cè)
        3.3.4 T_0代轉(zhuǎn)基因擬南芥的Kan抗性篩選
        3.3.5 T_0代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)
        3.3.6 T_2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
    3.4 討論
第四章 LcANSp啟動(dòng)子EMSA分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株與克隆載體
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)器材
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 獲得啟動(dòng)子片段
        4.2.2 提取垂花百合花被片核蛋白
        4.2.3 P1-P5系列DNA探針的標(biāo)記
        4.2.4 生物素標(biāo)記探針標(biāo)記效率的檢測(cè)
        4.2.5 EMSA膠的配制
        4.2.6 EMSA結(jié)合反應(yīng)
        4.2.7 電泳
        4.2.8 轉(zhuǎn)膜
        4.2.9 交聯(lián)
        4.2.10 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 探針制備結(jié)果
        4.3.2 垂花百合核蛋白與LcANSp啟動(dòng)子EMSA分析
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]真核啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 湯方,涂慧珍.  林業(yè)科技開(kāi)發(fā). 2015(02)
[3]植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 李田,孫景寬,劉京濤.  生物技術(shù)通報(bào). 2015(02)
[4]Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation[J]. LI Xiu-ying,LANG Zhi-hong,ZHANG Jie,HE Kang-lai,ZHU Li,HUANG Da-fang.  Journal of Integrative Agriculture. 2014(05)
[5]組織特異性啟動(dòng)子在作物基因工程中的研究進(jìn)展[J]. 賀紅霞,陳亮,林春晶,柳青.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2014(09)
[6]植物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 孫芳芳,宋洪元.  南方園藝. 2014(02)
[7]激素和非生物脅迫對(duì)月季RhPIP1;1啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用[J]. 陰霞,陳雯,王磊,楊若韻,薛璟祺,高俊平.  園藝學(xué)報(bào). 2014(01)
[8]高羊茅FaChit1基因啟動(dòng)子的功能分析[J]. 王仕英,王浩如,王健.  植物科學(xué)學(xué)報(bào). 2013(06)
[9]一個(gè)水稻鞘葉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆及功能鑒定[J]. 顏彥,林擁軍.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2013(07)
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碩士論文
[1]擬南芥干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆及功能分析[D]. 吳憲.吉林大學(xué) 2013
[2]紫花苜蓿MsZFN鋅指蛋白基因啟動(dòng)子MsZPP的克隆與序列分析[D]. 李燕.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3294227