發(fā)布時間：2021-07-20 07:40

　　黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國重要的園藝作物之一。黃瓜也是一種典型的喜氮作物,氮素缺乏會嚴重影響植株的生長,最終影響黃瓜的產(chǎn)量及品質(zhì)。為了追求更高的產(chǎn)量,黃瓜生產(chǎn)上會出現(xiàn)過量施用氮肥的現(xiàn)象,過量施用氮肥時作物對氮的利用率低,并且殘留的氮肥會破壞農(nóng)業(yè)及生態(tài)環(huán)境,科學施用氮肥的同時挖掘黃瓜響應低氮基因、培育響應低氮黃瓜品種是解決上述問題的有效途徑。本研究以黃瓜D0328為試驗材料,結(jié)合前期試驗結(jié)果,利用RT-PCR同源序列克隆技術,克隆黃瓜響應氮素脅迫相關基因CsAOC3,利用qRT-PCR技術對CsAOC3表達情況進行了檢測,并進一步通過轉(zhuǎn)基因技術對其功能進行了分析。主要研究結(jié)果如下:（1）結(jié)合實驗室前期表達譜數(shù)據(jù)結(jié)果,篩選獲得了一個可能參與黃瓜響應氮素脅迫的基因CsAOC3,以黃瓜葉片cDNA為模板,利用黃瓜基因組網(wǎng)站基因序列信息設計引物,經(jīng)PCR擴增出1條約750 bp的亮帶,測序結(jié)果表明其基因全長為753 bp,蛋白編碼251個氨基酸,蛋白質(zhì)的分子量為27.17kD,不穩(wěn)定系數(shù)為51.92,理論等電點為8.93,平均親水系數(shù)為-0.155。蛋白同源比對結(jié)果表明C... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－３?蛋Ｈ保守結(jié)構域分析??

?１??０２??圖３－４?ＣｓＡＯＣ３蛋Ｈ與其他植物ＡＯＣ蛋閂系統(tǒng)進化樹分析??Ｆｉｇ．３－４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣｓＡＯＣ３?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ｐｌａｎｔ?ＡＯＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??３．４?Ｃ＾４０Ｃ３在低氮脅迫條件下的表達分析??在播種３７?ｄ后對低氮處理和正常氮處理的兩個黃瓜品系Ｄ０３２８和Ｄ０４２２第３片葉進行??取材，提取總ＲＮＡ，通過反轉(zhuǎn)朵獲得ｃＤＮＡ〇利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技術對Ｄ０３２８和Ｄ０４２２兩個響??應低氮能力不同的黃瓜品系在低氮和正常氮情況下表達情況進行了分析（圖５）。??結(jié)果表明，和正常氮處理相比，響應低氮脅迫的黃瓜Ｄ０３２８在低氮脅迫條件件下ＣＭＯＣＪ的??表達景顯著上調(diào)，增加了?１１倍之多；而對于響應低氮脅迫弱的黃瓜Ｄ０４２２，在低氮脅迫處理??和正常氮處理時Ｃ＾ＩＯＣＪ的表達量并沒有明顯變化（圖５）。??１６

３．５．３質(zhì)粒雙酶切驗證??對經(jīng)過純化回收的目的片段再用限制性內(nèi)切酶；Ｉ和Ｉ對其進行雙酶切鑒定。??ＰＣＲ結(jié)果顯示如圖３－８，泳道２、３為ＰＣＲ擴增出的耐低氮基因Ｃ＾ＯＣ？片段，進一步證明??Ｃ＾４（？Ｃ５基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入表達載體。??．￥■?＇＾―ｉ??Ｍ：２ＫＭａｋｅｎ?２、３目的基因條帶：丨、４：陰性對照??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?２Ｋ；?２，?３：?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｂａｎｄ；?１，４：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｐｌａｎｔ；??圖３－８重組質(zhì)粒雙酶切驗證??Ｆｉｇ?３－８?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．５．４重組質(zhì)粒導入根癌農(nóng)桿菌??農(nóng)桿菌是常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，又被稱為“自然界最小的遺傳工程師”，農(nóng)桿菌介??疔法具有簡便、高效、低拷Ｗ數(shù)等特點【７３］。本研究也試圖通過農(nóng)桿菌將ＲＮＡ干涉片段疔入??擬南芥中。因此，將ＰＢＩ１２１－Ｃ＾ＯＣＪ表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)奸菌是構建ＲＮＡ表達載體的關鍵一步。??本實驗采用冷溶法制備感受態(tài)細胞，對已導入超表達載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒ＤＮＡ，進行??ＰＣＲ檢測，檢測其是否含有表達載體，結(jié)果如３－９圖，泳道１、２、３、４、５含有Ｈ的條帶，??表明該菌落含有已經(jīng)構建好的載體，并從中選出最好的陽性菌落進行擴大培養(yǎng)，以便于對擬??南芥進行侵染。??２０??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]An ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS 5 gene mutation confers light green peel in cucumber[J]. Qian Zhou,Shenhao Wang,Bowen Hu,Huiming Chen,Zhonghua Zhang,Sanwen Huang.  Journal of Integrative Plant Biology. 2015(11)
[2]低氮脅迫對不同耐低氮性玉米品種苗期生長和生理特性的影響[J]. 李強,羅延宏,龍文靖,孔凡磊,楊世民,袁繼超.  草業(yè)學報. 2014(04)
[3]黃瓜嫩果皮顏色的遺傳研究[J]. 王建科,方小雪,李雪紅,陳瑤,萬正杰,徐躍進.  園藝學報. 2013(03)
[4]黃瓜白色果皮基因遺傳規(guī)律及定位研究[J]. 董邵云,苗晗,張圣平,劉苗苗,王燁,顧興芳.  西北植物學報. 2012(11)
[5]唐菖蒲丙二烯氧化物環(huán)化酶基因GhAOC的克隆與表達分析[J]. 連青龍,李曉昕,鐘雄輝,尹義蕾,義鳴放.  中國農(nóng)業(yè)大學學報. 2012(05)
[6]黃瓜果實相關性狀QTL定位分析[J]. 苗晗,顧興芳,張圣平,張忠華,黃三文,王燁,程周超,張若緯,穆生奇,李曼,張振賢,方智遠.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2011(24)
[7]黃瓜無毛基因gl-2的遺傳分析和定位[J]. 楊雙娟,苗晗,張圣平,程周超,周健,董邵云,Todd C.Wehner,顧興芳.  園藝學報. 2011(09)
[8]黃瓜嫩果白色果皮顏色遺傳規(guī)律及其AFLP標記研究[J]. 孫曉丹,商慶梅,秦智偉.  北方園藝. 2011(03)
[9]Chi基因的克隆及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得[J]. 張茹,李金花,柴兆祥,張俊蓮,張金文,王蒂.  草業(yè)學報. 2009(06)
[10]茉莉酸類化合物的合成研究進展[J]. 李祖光,李建亮,沈德隆.  浙江化工. 2008(09)

博士論文
[1]水稻耐低氮基因克隆與功能分析[D]. 張陽軍.中國農(nóng)業(yè)大學 2015
[2]大豆氮素利用效率相關基因的克隆及功能驗證[D]. 郝青南.中國農(nóng)業(yè)科學院 2013
[3]耐鹽相關基因mangrin和ZRP4的克隆、分析與功能研究[D]. 張文惠.西北農(nóng)林科技大學 2006

碩士論文
[1]長春花茉莉酸生物合成途徑關鍵酶基因的克隆與表達分析[D]. 王名雪.上海交通大學 2013
[2]黃瓜固定標記圖譜的構建及果皮光澤（D）、小刺（ss）性狀定位及甘藍抽薹性狀基因的分子標記定位[D]. 杜輝.上海交通大學 2008
[3]紅樹林耐鹽基因（AOC）的克隆及其轉(zhuǎn)化熱研五號柱花草的初步探討[D]. 段瑞軍.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學 2004



本文編號：3292413