南瓜根系發(fā)達、抗逆性強,常被用作西瓜及其他葫蘆科作物的砧木。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),采用耐鹽南瓜砧木嫁接黃瓜可以有效限制Na⁺向地上部運輸,提高黃瓜的耐鹽能力。Cm HKT1是Na⁺轉(zhuǎn)運蛋白,主要功能是卸載木質(zhì)部的Na⁺,關(guān)于Cm HKT1參與鹽脅迫響應(yīng)的分子調(diào)控機制仍然未知。ERF是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,能夠參與多種植物逆境調(diào)控。截至目前,在多個植物體全基因組中鑒定了ERF家族成員,而南瓜中未有報道。因此,本論文研究工作從南瓜ERF基因家族鑒定和鹽脅迫下表達譜分析、南瓜Cm HKT1互作蛋白的篩選及功能驗證兩個方面開展,所取得的結(jié)果如下:1. 利用生物信息學(xué)方法在南瓜全基因組中共鑒定到131個ERF家族成員。根據(jù)系統(tǒng)進化樹聚類關(guān)系,將南瓜ERF成員分為12個小組。南瓜ERF家族成員均含有3個β折疊、1個α螺旋,同一個ERF小組內(nèi)motif數(shù)量、種類以及排列順序具有一致性,進一步說明分組的可靠性。2. 南瓜131個ERF成員中大約17%來源于散點復(fù)制,81%來源于染色體片段復(fù)制。伴隨著南瓜最近一次（30 MYA,Ks～... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

鹽脅迫下植物排Na+機制（Almeidaetal2017）

鹽脅迫下南瓜ERF基因的鑒定及CmHKT1互作蛋白的篩選5CY162[MATa,Δtrk1,trk2::pCK64，his3,leu2,ura3,trp1,ade2]trk1和trk2的功能。同時，將其轉(zhuǎn)入鹽敏感酵母菌株G19（Δena1-4），發(fā)現(xiàn)其Na+轉(zhuǎn)運特性缺失。結(jié)合上面的研究發(fā)現(xiàn)，可以依據(jù)PA-Loop的保守位點是Ser或Gly來判斷HKT離子吸收轉(zhuǎn)運特性，因此可以分為Ⅰ類（鈉離子轉(zhuǎn)運特性）和Ⅱ類（Na+-K+協(xié)同轉(zhuǎn)運特性）HKT蛋白(Mseretal2002)。但還有一些研究發(fā)現(xiàn)，僅僅依據(jù)PA-Loop區(qū)域的保守位點不一定能準確的判斷某個HKT成員屬于Ⅰ類還是Ⅱ類，鹽芥中有兩個HKT家族成員，分別是EpHKT1;1和EpHKT1;2，酵母表達實驗發(fā)現(xiàn)EpHKT1;1對Na+高親和性，而EpHKT1;2則對K+高親和性，經(jīng)序列比對，兩個HKT蛋白序列中PB-Loop區(qū)域的一個位點存在著差異，分別對應(yīng)Asn213和Asp205，而把EpHKT1;2的Asp205突變成Asn，那么EpHKT1;2則表現(xiàn)為Na+親和性，表明PB-Loop區(qū)域的Asp/Asn位點能夠決定Ⅰ類HKT蛋白的離子轉(zhuǎn)運特性(Alietal2018)。因此得出結(jié)論，僅通過PA-LoopSer/Gly位點來判定HKT的離子轉(zhuǎn)運類型是不夠充分的。本課題組的孫靜宇將含有空載質(zhì)粒和CmHKT1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入鹽敏感酵母菌株G19，在100mMNaCl的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有CmHKT1的G19酵母的生長受到明顯抑制。另一方面，CmHKT1不能互補K+吸收缺陷酵母WΔ6trk1和trk2的功能。結(jié)合兩部分實驗結(jié)果得出結(jié)論，南瓜CmHKT1屬于Ⅰ類HKT成員且具有Na+轉(zhuǎn)運特性（孫靜宇2019）。圖1-2植物HKT蛋白的結(jié)構(gòu)及分類（Hamamotoetal2015)Fig.1-2StructureandclassificationofplantHKTprotein

鹽脅迫下南瓜ERF基因的鑒定及CmHKT1互作蛋白的篩選71.2.2.4膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交廣泛用于細胞核內(nèi)互作蛋白的篩選工作，然而對于膜蛋白來說，這種方法存在局限性。瑞士DualsystemsBiotechAG公司推出了一種基于分離的泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，能夠很方便地用于膜蛋白相互作用的檢測（Stagljaretal1998）。原理如圖1-3所示。泛素是一個分子量小且高度保守的蛋白，能夠與賴氨酸殘基結(jié)合對其他蛋白進行標記，被標記的蛋白被26S蛋白酶降解(PickartandEddins2004)。Johnsson等人發(fā)現(xiàn)泛素能夠人為的分成兩個部分：N端（Nub）、C端（Cub）(JohnssonandVarshavsky1994)。正常情況下，Nub和Cub仍具有很高的親和力，仍發(fā)揮降解蛋白質(zhì)的信號功能，因此將Nub的第三位異亮氨酸變成甘氨酸形成NubG，這樣與Cub的親和能力大大降低，避免了Cub與Nub自我結(jié)合或接近的可能性。將Cub部分與人工合成的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下NubG不與Cub結(jié)合，泛素特異蛋白酶UBPs不能識別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子不會被切下來。因此，利用這一設(shè)計原理，可以將要檢測的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-LexA-VP16）和prey融合蛋白（prey-NubG）。一旦bait和prey發(fā)生相互作用，就會使得NubG和Cub的相互接近，重新組合成泛素，UBPs識別重組泛素后導(dǎo)致LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子的解離，于是LexA-VP16進入細胞核激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，通過對報告基因的檢測結(jié)果判斷蛋白蛋白之間的相互作用（StagljarandFields2002）。圖1-3分離泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交原理（Thaminyetal2003）Fig.1-3Theprincipleofseparatingubiquitin-mediatedmembraneproteinyeasttwo-hybrid

【參考文獻】：
期刊論文
[1]植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子及其在非生物脅迫應(yīng)答中的作用[J]. 高春艷,吳芮,袁玉,劉同玥,任莉萍.  江漢大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2017(03)
[2]COPII各組分在蛋白質(zhì)分泌途徑中的功能[J]. 徐曉峰,普雪嬌,莫蓓莘.  生命科學(xué). 2016(04)
[3]南瓜植物的起源和分類[J]. 林德佩.  中國西瓜甜瓜. 2000(01)

博士論文
[1]南瓜CmHKT1;1提高黃瓜嫁接苗耐鹽性的機理及相關(guān)microRNAs鑒定[D]. 孫靜宇.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019

碩士論文
[1]籽用南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 劉超.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3288119