高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）是多年生禾本科羊茅屬（Festuca）草本植物,因其抗逆性強、耐踐踏、耐粗放管理,被廣泛應用于水土保持及綠化工程;冷季型草在夏季有“休眠”現(xiàn)象,這限制了高羊茅在夏季的使用,所以延長高羊茅綠期是重要的育種目標之一。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯技術,因其系統(tǒng)構(gòu)建簡單、精準度髙、能同時對多個位點進行定點編輯、成本低等優(yōu)點成為目前研究的熱點。本研究利用Ca（Cl O）2代替升汞消毒劑,優(yōu)化高羊茅種子消毒方式;再運用CRISPR/Cas9基因編輯技術構(gòu)建高羊茅Fa SGR基因敲除載體;最后利用農(nóng)桿菌介導法將該表達載體轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織內(nèi)進行遺傳表達,并通過測序和實時熒光PCR技術檢驗轉(zhuǎn)基因植株中SGR基因的突變和表達情況,為CRISPR/Cas9基因編輯技術在高羊茅遺傳改良上的運用奠定研究基礎,主要結(jié)論如下:1)利用Ca（Cl O）2作為消毒劑處理高羊茅種子（升汞消毒劑為對照組）,以三種不同的前處理方式與不同濃度Ca（Cl O）2溶液和不同消毒時間相配合,分別對高羊茅種子進行消毒。結(jié)果表明前處理方式僅用Ca（Cl ... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 SGR基因的研究進展
        1.1.1 SGR基因
        1.1.2 葉綠素降解及SGR基因的功能
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及其在植物中的應用
        1.2.1 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)
        1.2.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)
        1.2.3 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在植物中的應用
    1.3 高羊茅及其基因工程研究進展
        1.3.1 高羊茅
        1.3.2 高羊茅基因工程的研究進展
    1.4 論文研究目的和意義
第2章 高羊茅再生體系的建立和消毒方式的優(yōu)化
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 材料
        2.1.2 再生體系建立
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 方法
        2.2.1 愈傷組織的誘導
        2.2.2 愈傷誘導培養(yǎng)條件
        2.2.3 再生體系的優(yōu)化
        2.2.4 最優(yōu)消毒處理方式下不同品種高羊茅驗證
        2.2.5 測定指標
        2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 不同前處理方式對種子消毒效果的影響
        2.3.2 不同高羊茅品種種子的發(fā)芽實驗
        2.3.3 最優(yōu)消毒處理下不同高羊茅品種種子的表現(xiàn)
    2.4 討論
第3章 CRISPR/Cas9技術敲除高羊茅FaSGR基因載體構(gòu)建
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 方法
        3.2.1 FaSGR基因CDS區(qū)相關外顯子序列的確定
        3.2.2 PCR產(chǎn)物測序
        3.2.3 FaSGR基因的sgRNA靶點的設計和選擇
        3.2.4 FaSGR最終載體的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 目的片段的克隆與驗證
        3.3.2 預計條帶的測序
        3.3.3 FaSGR-gRNA靶點酶切驗證
        3.3.4 靶點體外切割活性檢測
        3.3.5 FaSGR質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.6 表達載體的鑒定和檢測
    3.4 討論
第4章 農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
    4.1 材料和儀器
        4.1.1 材料
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 實驗儀器
    4.2 方法
        4.2.1 農(nóng)桿菌細胞活化
        4.2.2 凍融法轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
        4.2.3 將FaSGR-Cas9表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        4.2.4 農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化
        4.2.5 陽性植株的鑒定
        4.2.6 轉(zhuǎn)基因株系基因表達量檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 FaSGR-Cas9表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其驗證
        4.3.2 卡那霉素濃度對農(nóng)桿菌生長的影響
        4.3.3 高羊茅愈傷組織對潮霉素的抗性
        4.3.4 抗性愈傷的篩選、分化和生根
        4.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和檢測
        4.3.6 野生型株系和轉(zhuǎn)基因株系中FaSGR基因表達量的檢測
    4.4 討論
第5章 總結(jié)
    5.1 本研究主要結(jié)論
    5.2 本研究特色與創(chuàng)新之處
    5.3 后續(xù)研究工作展望
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]高羊茅應答鹽脅迫的AtSOS途徑基因的效應分析[J]. 麻冬梅,秦楚,倪星,許興,郭伶娜.  草業(yè)學報. 2016(12)
[2]植物葉綠素降解機制研究進展[J]. 丁躍,吳剛,郭長奎.  生物技術通報. 2016(11)
[3]CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術的發(fā)展與在作物遺傳育種中的應用[J]. 景潤春,盧洪.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2016(07)
[4]轉(zhuǎn)SOS基因高羊茅的耐鹽性鑒定[J]. 倪星,秦楚,平玲,麻冬梅,許興.  草原與草坪. 2016(01)
[5]CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術及其在作物品種改良中的應用[J]. 平文麗,李雪君,林娟,丁燕芳,孫煥,孫計平.  中國農(nóng)學通報. 2016(05)
[6]高羊茅FaSRP基因克隆及在非生物脅迫下表達分析（英文）[J]. 于二汝,李小冬,舒健虹,吳佳海,王小利.  Agricultural Science & Technology. 2015(10)
[7]CRISPR/Cas9基因組編輯技術在植物基因功能研究及植物改良中的應用[J]. 曾秀英,侯學文.  植物生理學報. 2015(09)
[8]植物滯綠基因STAY-GREEN的研究進展[J]. 孫佩光,吳瓊,徐碧玉,常勝合,苗紅霞,金志強.  植物生理學報. 2015(07)
[9]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點編輯中的研究進展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2015(09)
[10]植物滯綠機理研究進展[J]. 孫佩光,吳瓊,徐碧玉,苗紅霞,金志強.  基因組學與應用生物學. 2015(02)

碩士論文
[1]高羊茅Fa5GR基因克隆及其RNAi基因沉默體系的構(gòu)建研究[D]. 文昭竹.湖南農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]雪里蕻滯綠基因SGR的克隆及轉(zhuǎn)化研究[D]. 代法國.重慶大學 2011



本文編號：3192287