高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）是多年生禾本科羊茅屬（Festuca）草本植物,因其抗逆性強(qiáng)、耐踐踏、耐粗放管理,被廣泛應(yīng)用于水土保持及綠化工程;冷季型草在夏季有“休眠”現(xiàn)象,這限制了高羊茅在夏季的使用,所以延長高羊茅綠期是重要的育種目標(biāo)之一。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯技術(shù),因其系統(tǒng)構(gòu)建簡單、精準(zhǔn)度髙、能同時(shí)對多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯、成本低等優(yōu)點(diǎn)成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究利用Ca（Cl O）2代替升汞消毒劑,優(yōu)化高羊茅種子消毒方式;再運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建高羊茅Fa SGR基因敲除載體;最后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織內(nèi)進(jìn)行遺傳表達(dá),并通過測序和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株中SGR基因的突變和表達(dá)情況,為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在高羊茅遺傳改良上的運(yùn)用奠定研究基礎(chǔ),主要結(jié)論如下:1)利用Ca（Cl O）2作為消毒劑處理高羊茅種子（升汞消毒劑為對照組）,以三種不同的前處理方式與不同濃度Ca（Cl O）2溶液和不同消毒時(shí)間相配合,分別對高羊茅種子進(jìn)行消毒。結(jié)果表明前處理方式僅用Ca（Cl ... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 SGR基因的研究進(jìn)展
        1.1.1 SGR基因
        1.1.2 葉綠素降解及SGR基因的功能
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及其在植物中的應(yīng)用
        1.2.1 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)
        1.2.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)
        1.2.3 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
    1.3 高羊茅及其基因工程研究進(jìn)展
        1.3.1 高羊茅
        1.3.2 高羊茅基因工程的研究進(jìn)展
    1.4 論文研究目的和意義
第2章 高羊茅再生體系的建立和消毒方式的優(yōu)化
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 材料
        2.1.2 再生體系建立
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 方法
        2.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)
        2.2.2 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)條件
        2.2.3 再生體系的優(yōu)化
        2.2.4 最優(yōu)消毒處理方式下不同品種高羊茅驗(yàn)證
        2.2.5 測定指標(biāo)
        2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 不同前處理方式對種子消毒效果的影響
        2.3.2 不同高羊茅品種種子的發(fā)芽實(shí)驗(yàn)
        2.3.3 最優(yōu)消毒處理下不同高羊茅品種種子的表現(xiàn)
    2.4 討論
第3章 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除高羊茅FaSGR基因載體構(gòu)建
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 方法
        3.2.1 FaSGR基因CDS區(qū)相關(guān)外顯子序列的確定
        3.2.2 PCR產(chǎn)物測序
        3.2.3 FaSGR基因的sgRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選擇
        3.2.4 FaSGR最終載體的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 目的片段的克隆與驗(yàn)證
        3.3.2 預(yù)計(jì)條帶的測序
        3.3.3 FaSGR-gRNA靶點(diǎn)酶切驗(yàn)證
        3.3.4 靶點(diǎn)體外切割活性檢測
        3.3.5 FaSGR質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.6 表達(dá)載體的鑒定和檢測
    3.4 討論
第4章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
    4.1 材料和儀器
        4.1.1 材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 方法
        4.2.1 農(nóng)桿菌細(xì)胞活化
        4.2.2 凍融法轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.2.3 將FaSGR-Cas9表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        4.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化
        4.2.5 陽性植株的鑒定
        4.2.6 轉(zhuǎn)基因株系基因表達(dá)量檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 FaSGR-Cas9表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其驗(yàn)證
        4.3.2 卡那霉素濃度對農(nóng)桿菌生長的影響
        4.3.3 高羊茅愈傷組織對潮霉素的抗性
        4.3.4 抗性愈傷的篩選、分化和生根
        4.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和檢測
        4.3.6 野生型株系和轉(zhuǎn)基因株系中FaSGR基因表達(dá)量的檢測
    4.4 討論
第5章 總結(jié)
    5.1 本研究主要結(jié)論
    5.2 本研究特色與創(chuàng)新之處
    5.3 后續(xù)研究工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高羊茅應(yīng)答鹽脅迫的AtSOS途徑基因的效應(yīng)分析[J]. 麻冬梅,秦楚,倪星,許興,郭伶娜.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2016(12)
[2]植物葉綠素降解機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 丁躍,吳剛,郭長奎.  生物技術(shù)通報(bào). 2016(11)
[3]CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術(shù)的發(fā)展與在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 景潤春,盧洪.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2016(07)
[4]轉(zhuǎn)SOS基因高羊茅的耐鹽性鑒定[J]. 倪星,秦楚,平玲,麻冬梅,許興.  草原與草坪. 2016(01)
[5]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在作物品種改良中的應(yīng)用[J]. 平文麗,李雪君,林娟,丁燕芳,孫煥,孫計(jì)平.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2016(05)
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[7]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在植物基因功能研究及植物改良中的應(yīng)用[J]. 曾秀英,侯學(xué)文.  植物生理學(xué)報(bào). 2015(09)
[8]植物滯綠基因STAY-GREEN的研究進(jìn)展[J]. 孫佩光,吳瓊,徐碧玉,常勝合,苗紅霞,金志強(qiáng).  植物生理學(xué)報(bào). 2015(07)
[9]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點(diǎn)編輯中的研究進(jìn)展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(09)
[10]植物滯綠機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 孫佩光,吳瓊,徐碧玉,苗紅霞,金志強(qiáng).  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2015(02)

碩士論文
[1]高羊茅Fa5GR基因克隆及其RNAi基因沉默體系的構(gòu)建研究[D]. 文昭竹.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]雪里蕻滯綠基因SGR的克隆及轉(zhuǎn)化研究[D]. 代法國.重慶大學(xué) 2011



本文編號：3192287