指狀青霉（Penicillium digitatum）是柑橘類水果的主要致病真菌,在采摘后的加工、貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中引起綠霉病而造成巨大損失。甾醇14a-脫甲基化酶抑制劑（DMIs）具有良好的殺真菌效果,但是抗藥性菌株的出現(xiàn)使得綠霉病的防治更加復(fù)雜且困難。面對這種情況,研究病原真菌的DMIs抗性分子機(jī)理具有十分重要意義。對于DMIs抗性分子機(jī)制的深入理解為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)及開發(fā)新型高效藥物提供基礎(chǔ)。MFS超家族蛋白（major facilitator superfamily）是普遍存在于整個(gè)生物界的一大類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有非常廣泛的生理功能。許多MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合特異性較低,能夠運(yùn)輸多種底物。研究發(fā)現(xiàn),微生物中這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過量表達(dá)可能導(dǎo)致多藥抗性。本文克隆了指狀青霉中一個(gè)新的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因——-Pdmfs2 ,探討了該基因與指狀青霉對咪酰胺藥物抗性之間的關(guān)系,并進(jìn)一步研究了Pdmfs2的其它功能。主要研究結(jié)果如下：1、在指狀青霉中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的MFS超家族蛋白基因,命名為Pdmfs2。該基因全長2115 bp,在211-261 bp、333-388 bp、681-731... 

【文章來源】：華中師范大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 DMIs類藥物研究及真菌抗藥性的產(chǎn)生
        1.1.1 DMIs類藥物研究
        1.1.2 真菌抗藥性的產(chǎn)生
    1.2 真菌對DMIs類藥物的抗性機(jī)制
        1.2.1 CYP51與真菌抗藥性
        1.2.2 藥泵蛋白與真菌抗藥性
        1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子與真菌抗藥性
    1.3 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
        1.3.1 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白概述
        1.3.2 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.3.3 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)理
    1.4 本文研究內(nèi)容及意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 化學(xué)試劑及藥品
        2.1.4 工具酶與試劑盒
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 真菌基因組DNA與總RNA的提取
        2.2.2 Pdmfs2基因的克隆
        2.2.3 基因及蛋白質(zhì)序列分析
        2.2.4 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量(RT-PCR)
        2.2.5 基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.6 基因回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.7 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.8 指狀青霉的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子篩選
        2.2.9 Southern blot分析
        2.2.10 對于咪酰胺EC_(50)值測定
        2.2.11 生長速率測定
        2.2.12 產(chǎn)孢率測定
        2.2.13 對于柑橘類水果侵染毒力測定
        2.2.14 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 Pdmfs2基因的克隆及序列分析
    3.2 Pdmfs2的轉(zhuǎn)錄水平分析
    3.3 Pdmfs2基因敲除及回補(bǔ)質(zhì)粒構(gòu)建
    3.4 Pdmfs2突變菌株的篩選與分析
    3.5 PdMFS2對于指狀青霉咪酰胺抗性及生長速率的作用
    3.6 PdMFS2影響指狀青霉產(chǎn)孢率及致毒力
4 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
衷心感謝以下基金資助
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[J]. 鄧東,顏寧.  科學(xué)通報(bào). 2015(08)
[2]植物病原真菌對甾醇生物合成抑制劑類（SBIs）殺菌劑的抗藥性研究進(jìn)展[J]. 葉滔,馬志強(qiáng),畢秋艷,牛芳勝,韓秀英,張小風(fēng),王文橋,張利輝.  農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào). 2012(01)
[3]植物內(nèi)生真菌抗腫瘤藥物研究進(jìn)展(英文)[J]. 邱敏,謝瑞生,史彧,陳海敏.  中國生物工程雜志. 2009(01)
[4]農(nóng)用殺菌劑作用機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 刁春玲,劉芳,宋寶安.  農(nóng)藥. 2006(06)
[5]植物病原菌抗藥性遺傳研究[J]. 袁善奎,周明國.  植物病理學(xué)報(bào). 2004(04)
[6]絲狀真菌對甾醇生物合成抑制劑的抗性分子機(jī)制[J]. 李紅葉,朱國念,朱金文,謝青云.  菌物系統(tǒng). 2002(02)
[7]抑制麥角甾醇生物合成的殺菌劑抗性研究[J]. 周明國.  農(nóng)藥. 1987(01)



本文編號(hào)：3167623