指狀青霉（Penicillium digitatum）是柑橘類水果的主要致病真菌,在采摘后的加工、貯藏、運輸和銷售過程中引起綠霉病而造成巨大損失。甾醇14a-脫甲基化酶抑制劑（DMIs）具有良好的殺真菌效果,但是抗藥性菌株的出現(xiàn)使得綠霉病的防治更加復雜且困難。面對這種情況,研究病原真菌的DMIs抗性分子機理具有十分重要意義。對于DMIs抗性分子機制的深入理解為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標及開發(fā)新型高效藥物提供基礎。MFS超家族蛋白（major facilitator superfamily）是普遍存在于整個生物界的一大類轉運蛋白,具有非常廣泛的生理功能。許多MFS轉運蛋白的底物結合特異性較低,能夠運輸多種底物。研究發(fā)現(xiàn),微生物中這類轉運蛋白基因的過量表達可能導致多藥抗性。本文克隆了指狀青霉中一個新的MFS轉運蛋白基因——-Pdmfs2 ,探討了該基因與指狀青霉對咪酰胺藥物抗性之間的關系,并進一步研究了Pdmfs2的其它功能。主要研究結果如下：1、在指狀青霉中發(fā)現(xiàn)了一個新的MFS超家族蛋白基因,命名為Pdmfs2。該基因全長2115 bp,在211-261 bp、333-388 bp、681-731... 

【文章來源】：華中師范大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 DMIs類藥物研究及真菌抗藥性的產生
        1.1.1 DMIs類藥物研究
        1.1.2 真菌抗藥性的產生
    1.2 真菌對DMIs類藥物的抗性機制
        1.2.1 CYP51與真菌抗藥性
        1.2.2 藥泵蛋白與真菌抗藥性
        1.2.3 轉錄因子與真菌抗藥性
    1.3 MFS轉運蛋白
        1.3.1 MFS轉運蛋白概述
        1.3.2 MFS轉運蛋白的結構
        1.3.3 MFS轉運蛋白的作用機理
    1.4 本文研究內容及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 化學試劑及藥品
        2.1.4 工具酶與試劑盒
    2.2 實驗方法
        2.2.1 真菌基因組DNA與總RNA的提取
        2.2.2 Pdmfs2基因的克隆
        2.2.3 基因及蛋白質序列分析
        2.2.4 反轉錄與熒光定量(RT-PCR)
        2.2.5 基因敲除質粒的構建
        2.2.6 基因回補質粒的構建
        2.2.7 農桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化
        2.2.8 指狀青霉的遺傳轉化與轉化子篩選
        2.2.9 Southern blot分析
        2.2.10 對于咪酰胺EC_(50)值測定
        2.2.11 生長速率測定
        2.2.12 產孢率測定
        2.2.13 對于柑橘類水果侵染毒力測定
        2.2.14 統(tǒng)計分析
3 結果與分析
    3.1 Pdmfs2基因的克隆及序列分析
    3.2 Pdmfs2的轉錄水平分析
    3.3 Pdmfs2基因敲除及回補質粒構建
    3.4 Pdmfs2突變菌株的篩選與分析
    3.5 PdMFS2對于指狀青霉咪酰胺抗性及生長速率的作用
    3.6 PdMFS2影響指狀青霉產孢率及致毒力
4 討論
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文
衷心感謝以下基金資助
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[7]抑制麥角甾醇生物合成的殺菌劑抗性研究[J]. 周明國.  農藥. 1987(01)



本文編號：3167623