本研究基于對漾濞大泡核桃（Juglans sigillata,Dode）受膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染前后轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的差異表達基因,根據(jù)編碼富含脯氨酸蛋白（proline-rich protein,PRP）的EST序列,通過快速擴增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技術(shù)從漾濞大泡核桃中克隆獲得一個新的PRP基因JsPRP1,并對其進行生物信息學(xué)分析。采用熒光定量PCR （quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR）技術(shù)分析JSPRP1在漾濞大泡核桃葉片中的表達特性。構(gòu)建JsPRP1基因的原核表達載體,誘導(dǎo)表達并純化目的蛋白,檢測重組目的蛋白的抗真菌活性。構(gòu)建pBIN m-gfp5-ER-JsPRP1載體并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefacies)EHA105中,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染洋蔥表皮細胞,在激光共聚焦顯微鏡下,借助綠色熒光蛋白信號確定JsPRP1的亞細胞定位。同時將JSPRP1轉(zhuǎn)入煙草（Nicotian... 

【文章來源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 核桃
        1.1.1 核桃病害
        1.1.2 核桃轉(zhuǎn)基因育種
    1.2 植物對炭疽病菌的抗性防衛(wèi)機理研究
        1.2.1 分子抗病研究
        1.2.2 化學(xué)物質(zhì)及代謝抗病研究
    1.3 植物富含脯氨酸蛋白
        1.3.1 富含脯氨酸蛋白的結(jié)構(gòu)特征及分類
        1.3.2 富含脯氨酸蛋白基因的表達特性
            1.3.2.1 發(fā)育階段和組織特異性表達
            1.3.2.2 對信號分子以及逆境脅迫的響應(yīng)
        1.3.3 富含脯氨酸蛋白的功能
            1.3.3.1 維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
            1.3.3.2 參與植物對逆境脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)
            1.3.3.3 其他功能
    1.4 脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白
    1.5 本課題的研究意義及目的
第二章 漾濞大泡核桃JsPRP1基因的克隆與表達特性分析
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 植物材料
        2.2.2 菌株和載體
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 緩沖液和培養(yǎng)基配方
    2.3 方法
        2.3.1 植物材料的處理及樣品采集
        2.3.2 RNA的提取及mRNA的分離
        2.3.3 5’RACE及3’RACE
            2.3.3.1 RACE引物設(shè)計
            2.3.3.2 RACE cDNA第一鏈的合成
            2.3.3.3 RACE擴增
        2.3.4 T-A克隆
            2.3.4.1 DNA片段連接
            2.3.4.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.3.5 全長cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析
            2.3.5.1 全長cDNA序列的擴增
            2.3.5.2 生物信息學(xué)分析
        2.3.6 基因編碼區(qū)序列擴增及內(nèi)含子分析
            2.3.6.1 CTAB法提取基因組DNA
            2.3.6.2 編碼區(qū)序列的擴增及內(nèi)含子分析
        2.3.7 qRT-PCR
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 JsPRP1全長cDNA克隆及內(nèi)含子分析
        2.4.2 生物信息學(xué)分析
            2.4.2.1 序列同源性分析
            2.4.2.2 理化性質(zhì)
            2.4.2.3 信號肽及亞細胞定位分析
            2.4.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測
            2.4.2.5 二級結(jié)構(gòu)分析
            2.4.2.6 多重序列比對和系統(tǒng)進化分析
            2.4.2.7 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.4.3 表達譜分析
    2.5 討論
第三章 JsPRP1的原核表達及抑菌活性分析
    3.1 前言
    3.2 材料與試劑
        3.2.1 菌株和載體
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 緩沖液和培養(yǎng)基配方
    3.3 方法
        3.3.1 JsPRP1的擴增
        3.3.2 原核表達載體的構(gòu)建
            3.3.2.1 質(zhì)粒提取及純化
            3.3.2.2 酶切反應(yīng)
            3.3.2.3 膠回收
            3.3.2.4 DNA連接
        3.3.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞
        3.3.4 His-JsPRP1融合蛋白的誘導(dǎo)表達
        3.3.5 外源蛋白的提取和純化
        3.3.6 外源蛋白的超濾濃縮
        3.3.7 外源蛋白抑菌活性的測定
            3.3.7.1 真菌的預(yù)培養(yǎng)
            3.3.7.2 平板抑菌實驗
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 JsPRP1原核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        3.4.2 JsPRP1的誘導(dǎo)表達
        3.4.3 融合蛋白的純化
        3.4.4 融合蛋白的抑菌活性分析
    3.5 討論
第四章 JsPRP1的亞細胞定位
    4.1 前言
    4.2 材料與試劑
        4.2.1 植物材料
        4.2.2 菌株和載體
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 緩沖液和培養(yǎng)基配方
    4.3 方法
        4.3.1 亞細胞定位載體的構(gòu)建
        4.3.2 農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備
2凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞">        4.3.3 CaCl₂凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞
        4.3.4 PCR反應(yīng)
        4.3.5 農(nóng)桿菌EHA105活化
        4.3.6 農(nóng)桿菌EHA105侵染洋蔥表皮
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 JsPRP1亞細胞定位載體的構(gòu)建
        4.4.2 JSPRP1亞細胞定位載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
        4.4.3 JsPRP1-GFP融合蛋白的亞細胞定位
    4.5 討論
第五章 JsPRP1在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析
    5.1 前言
    5.2 材料與試劑
        5.2.1 植物材料
        5.2.2 菌株和載體
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 緩沖液和培養(yǎng)基配方
    5.3 方法
        5.3.1 植物超表達載體的構(gòu)建
        5.3.2 農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞的制備
2凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞">        5.3.3 CaCl₂凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞
        5.3.4 PCR反應(yīng)
        5.3.5 農(nóng)桿菌LBA4404活化
        5.3.6 葉盤轉(zhuǎn)化法
        5.3.7 轉(zhuǎn)基因煙草的篩選
        5.3.8 轉(zhuǎn)基因煙草中JsPRP1表達水平分析
        5.3.9 轉(zhuǎn)基因煙草的非生物脅迫處理
        5.3.10 轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性分析
        5.3.11 數(shù)據(jù)處理
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 JsPRP1植物超表達載體的構(gòu)建
        5.4.2 JsPRP1植物超表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
        5.4.3 JsPRP1轉(zhuǎn)基因煙草的產(chǎn)生
        5.4.4 JsPRP1轉(zhuǎn)基因煙草的篩選
        5.4.5 轉(zhuǎn)基因煙草中JsPRP1的轉(zhuǎn)錄水平分析
        5.4.6 轉(zhuǎn)基因煙草提高了對干旱和鎘脅迫的耐受性
        5.4.7 轉(zhuǎn)基因煙草的膠孢炭疽菌的耐受性
    5.5 討論
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
致謝
參考文獻
附錄 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文
申請專利



本文編號：3162407