香菇多糖在香菇菌絲和子實(shí)體中含量很低,導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)量低成本高,難以滿足市場(chǎng)需求,因此應(yīng)用遺傳育種手段選育香菇多糖高產(chǎn)菌株十分必要。本實(shí)驗(yàn)采用啟動(dòng)子替代技術(shù)構(gòu)建香菇多糖高產(chǎn)工程菌,應(yīng)用平菇gpd啟動(dòng)子替代香菇葡聚糖合成酶基因gls的啟動(dòng)子,提高葡聚糖合成酶基因的表達(dá),提高香菇多糖產(chǎn)量。結(jié)果如下:（1）從PAN7-1質(zhì)�？寺〉玫匠泵顾乜剐曰虮磉_(dá)盒D2（3321 bp）,從香菇L26基因組中克隆得到gls基因啟動(dòng)子上游序列（上游同源臂）D1（870 bp）、gls基因起始密碼子下游序列（下游同源臂）D4（867 bp）,從平菇新831基因組中克隆得到gpd啟動(dòng)子D3（950 bp）。用融合PCR把上游同源臂與潮霉素抗性基因表達(dá)盒融合在一起,連到PMD19-T載體得到PMDF19-T質(zhì)粒。用融合PCR把gpd啟動(dòng)子與下游同源臂融合在一起,連到pEASY-BluntE1載體上得到PEASY-Blunt-F質(zhì)粒。對(duì)兩個(gè)構(gòu)建好的質(zhì)粒分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),用AscI與PacI雙酶切PMDF19-T質(zhì)粒,得到D1和D2的融合片段（4191 bp）,用PacI酶切PEASY-Blunt-F質(zhì)粒使之線性化,... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒Lhg-R的構(gòu)建Fig.2-1TheconstractionoftheplasmidLhg-R

A BC D圖 2-2：同源重組片段的 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖kb pLus DNA Ladder A；1：左臂 870bp；B；1：潮霉素抗性基因 3321bp2: ELectrophoresis pLot of PCR product of homoLogous recombination fragment.pLus DNA Ladder A; 1: Left arm 870bp; B; 1: hygromycin resistant gene 3321bp.

L26 下游同源臂擴(kuò)增結(jié)果如圖 2-2，2-3 所示。成功克隆出所需的目的基因以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。abA B圖 2-2：同源重組片段的 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖:1kb pLus DNA Ladder A；1：左臂 870bp；B；1：潮霉素抗性基因 3321bp2-2: ELectrophoresis pLot of PCR product of homoLogous recombination fragment.b pLus DNA Ladder A; 1: Left arm 870bp; B; 1: hygromycin resistant gene 3321bp.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]啟動(dòng)子替代構(gòu)建糙皮側(cè)耳漆酶高產(chǎn)菌株[J]. 劉冬忍,田芳,王小飛,王景冒,戚元成,宋安東,申進(jìn)文,邱立友.  菌物學(xué)報(bào). 2016(05)
[3]轉(zhuǎn)座子中關(guān)于轉(zhuǎn)座機(jī)制及相關(guān)技術(shù)的探究[J]. 尹洋.  赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015(18)
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[5]兩步融合PCR法構(gòu)建煙曲霉ssk1基因敲除株[J]. 馬彥,岑雯,劉昕,馮文莉.  山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(04)
[6]香菇多糖提取方法的研究[J]. 石來寶,陳靜,殷霞.  藥學(xué)研究. 2014(04)
[7]不同烘干方法對(duì)香菇干燥品質(zhì)的影響[J]. 金昌福.  延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào). 2013(04)
[8]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)雙價(jià)載體pPK2轉(zhuǎn)化黑曲霉條件的研究[J]. 王艷,王文雅,袁其朋.  食品科技. 2013(08)
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博士論文
[1]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在靈芝三萜生物合成研究中的應(yīng)用[D]. 師亮.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012

碩士論文
[1]香菇罐藏類食品的研制及HACCP在其加工中的應(yīng)用[D]. 席甜.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]真菌強(qiáng)啟動(dòng)子活性片段的克隆及轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建[D]. 何瑩瑩.浙江農(nóng)林大學(xué) 2013
[3]VDHl和GPCR基因在大麗輪枝菌微菌核發(fā)育過程中的功能研究[D]. 陳婷.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[4]平菇NADPH氧化酶基因noxA的克隆及其功能的研究[D]. 李銀鳳.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[5]阿魏化學(xué)成分對(duì)阿魏側(cè)耳菌絲生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)表達(dá)的研究[D]. 白羽嘉.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[6]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及突變體篩選[D]. 葉小波.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[7]華山新麥草附加系抗條銹病基因的遺傳作圖和小麥條銹菌毒性突變體的研究[D]. 張亮.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2009
[8]香菇農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及BCA基因轉(zhuǎn)化研究[D]. 喻義贛.福建農(nóng)林大學(xué) 2009



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