原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細胞雜交技術(shù)為柑橘遺傳育種工作開辟了一條新思路,它已成為柑橘砧木及接穗品種改良的重要手段。目前,柑橘原生質(zhì)體主要由愈傷組織和葉片分離而來,但只有來于前者的原生質(zhì)體能持續(xù)分裂并再生,而葉肉原生質(zhì)體目前還不能單獨用于柑橘遺傳改良。迄今,這兩種類型原生質(zhì)體再生能力差異的機制尚不清楚。已有研究表明,活性氧（ROS）引起的氧化脅迫可能是造成不可再生型原生質(zhì)體再生難的原因,然而另一方面ROS作為信號分子,對原生質(zhì)體再生具有重要的調(diào)控作用,抑制其產(chǎn)生會導致原生質(zhì)體不可分裂再生�；诖�,本論文以椪柑愈傷組織和葉片為起始材料,采用熒光標記法分析了ROS在椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)中的動態(tài)變化,同時通過NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI和過氧化物酶抑制劑NaN3處理探究了其ROS的來源；分析了NADPH氧化酶基因家族成員在碰柑原生質(zhì)體分離培養(yǎng)過程中的表達情況,克隆了一個特異表達的NADPH氧化酶基因（ Crrboh10）；構(gòu)建了Crrboh10的過表達載體,通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因愈傷組織,并測定了碰柑轉(zhuǎn)基因愈傷組織和非轉(zhuǎn)基因愈傷組織的可溶性蛋白含量和H202含量。主要研究結(jié)果如下：1... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 綜述
    1.1 植物活性氧的研究進展
        1.1.1 活性氧產(chǎn)生
        1.1.2 植物細胞中活性氧的生理作用研究
    1.2 植物NADPH氧化酶的研究進展
        1.2.1 植物質(zhì)膜NADPH氧化酶的概述
        1.2.2 植物NADPH氧化酶基因結(jié)構(gòu)特點
        1.2.3 植物NADPH氧化酶的功能
    1.3 研究的目的和意義
第二章 椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中活性氧動態(tài)變化及來源研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 試驗方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)中ROS的亞細胞定位與時空變化研究
        2.2.2 抑制劑對ROS亞細胞定位與時空變化影響的研究
    2.3 討論
第三章 NADPH氧化酶基因家族特異性表達分析及椪柑Crrboh10基因克隆與分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 試劑
        3.1.3 試驗方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 椪柑體原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中NADPH氧化酶基因家族的表達分析
        3.2.2 椪柑Crrboh10基因克隆與生物學信息分析
        3.2.3 椪柑Crrboh10的組織特異性表達分析
    3.3 討論
第四章 椪柑Crrboh10基因過表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 試劑
        4.1.3 試驗方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 椪柑Crrboh10基因PCR擴增
        4.2.2 椪柑Crrboh10基因及表達載體質(zhì)粒的酶切反應(yīng)
        4.2.3 椪柑Crrboh10重組質(zhì)粒的PCR、酶切驗證及轉(zhuǎn)化
        4.2.4 椪柑Crrboh10農(nóng)桿菌表達載體的驗證
        4.2.5 卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）有效選擇壓的確定
        4.2.6 篩選抗性愈傷組織
        4.2.7 轉(zhuǎn)基因植株GUS染色驗證和PCR檢測
        4.2.8 轉(zhuǎn)基因愈傷組織生理指標的變化
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]植物Rboh基因功能及其活性調(diào)節(jié)機制的研究進展[J]. 劉秋圓,賀浩華,胡麗芳.  生物技術(shù)通報. 2013(11)
[2]OsRboh基因家族在水稻免疫應(yīng)答中的表達及功能分析[J]. 李業(yè),陳銀華,吳家和,何朝族.  生物工程學報. 2011(11)
[3]辣椒煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因（NADPH）在辣椒中的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗病性鑒定[J]. 包良帥,鞏振輝,柴貴賢,李大偉.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2011(01)
[4]植物NADPH氧化酶研究進展[J]. 丁坤峰,譚曉榮.  生命科學. 2010(08)
[5]紫外線滅活的原生質(zhì)體作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)柑橘原生質(zhì)體的研究[J]. 徐小勇,劉繼紅.  江蘇農(nóng)業(yè)科學. 2009(06)
[6]水分脅迫誘導玉米Zm rboh基因表達及ABA在其中的作用[J]. 趙宇,蔣明義,張阿英,林凡.  南京農(nóng)業(yè)大學學報. 2008(03)
[7]ABA在植物細胞抗氧化防護過程中的作用[J]. 許樹成,丁海東,魯銳,石犇,馬芳芳.  中國農(nóng)業(yè)大學學報. 2008(02)
[8]水分脅迫積累的ABA誘導抗氧化防護系統(tǒng)的信號級聯(lián)[J]. 胡秀麗,劉瑞俠,毛訓甲.  西北植物學報. 2007(05)
[9]NaCl對小麥根質(zhì)膜NADPH氧化酶活性的影響[J]. 楊穎麗,安黎哲,張立新.  西北植物學報. 2006(12)
[10]活性氧:從毒性分子到信號分子——活性氧與細胞的增殖、分化和凋亡及其信號轉(zhuǎn)導途徑[J]. 景亞武,易靜,高飛,湯雪明.  細胞生物學雜志. 2003(04)

博士論文
[1]靈芝基因沉默體系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析[D]. 穆大帥.南京農(nóng)業(yè)大學 2013
[2]玉米（Zea mays L.）NADPH氧化酶基因克隆、表達特性及功能研究[D]. 林凡.南京農(nóng)業(yè)大學 2008
[3]煙草NADPH氧化酶在Na～+、Cu～（2+）脅迫中的活性變化及其作用[D]. 于中連.中國農(nóng)業(yè)大學 2005
[4]植物質(zhì)膜NADPH氧化酶參與ABA和鎳離子誘導的活性氧積累[D]. 郝福順.中國農(nóng)業(yè)大學 2005



本文編號：3106714