甘藍（Brassica oleracea L.）是我國重要的蔬菜作物,每年栽培面積可達90萬hm2,在蔬菜周年均衡供應中占有重要地位。甘藍是典型的異花授粉植物,雜種優(yōu)勢明顯。甘藍具有自交不親和特點使其繁殖需要采用蕾期人工授粉,費時費工、效率低、成本高,大大限制了雄性不育系在雜種優(yōu)勢育種中的應用。隨著甘藍自交不親和遺傳機制、控制自交不親和性基因明確,以基因組編輯為主的反向遺傳學技術可以對其關鍵基因進行精準改造,為培育自交親和系提供了可能。其中CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)為精準修飾目的基因的實現(xiàn)提供了一套更加簡便高效的研究方案。CRISPR/Cas9技術只對靶位點序列進行修飾,T0代植株中的表達載體序列可以通過后代自交分離獲得不含任何外源DNA序列的非轉基因植株,本質上和傳統(tǒng)育種方法獲得的突變體材料沒有區(qū)別。一些國家對利用CRISPR/Cas9技術獲得的農作物產品批準上市不受GMO條件約束。本研究利用這種“神奇”的基因組精準編輯技術精準敲除甘藍BoPDS、SRK、BoGA4基因和煙草Nt PDS基因。另外,以煙草和甘藍為對象,開展CRISPR/Cas9基因編輯體系的優(yōu)化,以期獲得更為簡... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機制示意圖

第 1 章 文獻綜述在實際應用過程中，研究者將 tracrRNA/crRNA 二聚體改造成單一向導 RNA（Single guide RNA, sgRNA）[9]，改造后的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要由具有核酸內切酶功能的 Cas9 蛋白和具有引導作用的 sgRNA 兩個主要元件組成，極大簡化了基因組編輯技術的研究與應用。目前已報道利用 CRISPR 基因組編輯方法都是利用sgRNA-Cas9 體系進行切割 DNA 雙鏈[16、17]。因此，CRISPR/Cas9 技術作用過程簡單地表述為通過具有特異性向導的 sgRNA 序列與靶序列進行堿基互補配對，并引導 Cas9 蛋白結合到靶序列，進行 DNA 切割產生 DSBs（Double-strand DNA breaks,DSBs），從而激活細胞的非同源性末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源重組修復機制（Homologous recombination, HR），從而實現(xiàn)基因敲除、插入、替換等突變（圖 1-2）。

ZFNs 技術特異性較低，效率不高，脫靶效應較明顯，并且操作相對繁瑣，昂貴。TALENs 技術特異性高，脫靶效應較低，也可以像 ZFNs 一樣對基因組編輯，但是 TALEN 蛋白較大，表達載體構建較為困難。而 CRISPR/Cas9 相FNs 及 TALENs 具有更強大的優(yōu)勢，表現(xiàn)在載體構建簡單易行，成本更低，可定點修飾多個靶位點，染色體大片段缺失，靶向效率更高，幾乎任何分子生實驗室都可以開展。上述特點使 CRISPR/Cas9 迅速替代了 ZFNs、TALENs 基輯技術，成為生物科學領域研究科學家的新寵。.4 DNA 斷裂修復機制DNA 作為生命活動中最重要的遺傳物質，調控各類蛋白質的合成，以保證機能正常運行。當外界環(huán)境變化造成 DNA 鏈斷裂，又不能及時得到修復，將響生物體的正常生命活動，甚至導致生物體死亡。因此，細胞在長期的進化中形成了自身的修復機制。基因組編輯技術就是利用核酸內切酶產生 DNA 雙裂經(jīng)過修復機制以實現(xiàn)基因組的定向修飾，為人類創(chuàng)造所需的遺傳變異體。，DNA 修復主要有兩種方式：非同源性末端連接和同源重組修復機制（圖 1-3）


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