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芒果GGPPS基因的克隆及其與果肉類胡蘿卜素合成相關(guān)性的研究

發(fā)布時間:2020-11-20 22:14
   芒果果肉中含有類胡蘿卜素、葉綠素等烯萜類物質(zhì),它們賦予了芒果豐富的營養(yǎng)價值和果實(shí)顏色。香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPPS)是類胡蘿卜素等烯萜類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵限速酶,其產(chǎn)物GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)是類胡蘿卜素等下游代謝物質(zhì)的共同前體。本研究以金煌、貴妃、椰香、紅玉和臺農(nóng)的果肉為研究材料,采用生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù),研究GGPPS基因?qū)笫爝^程中果肉類胡蘿卜素積累的調(diào)控機(jī)制。取得以下研究結(jié)果。1.采用RACE技術(shù),從芒果果肉中克隆了 GGPPS基因,其cDNA理論全長為1247 bp,開放閱讀框全長為1113bp,編碼369個氨基酸。該基因與薔薇GGPPS(AAM21639.1)氨基酸序列同源性為78%,氨基酸序列分析表明該序列含有兩個DDx(2-4)D保守基元(FARM和SARM)和一個CxxxC基元,聚類結(jié)果表明此基因與其它物種的GGPPS大亞基聚在一起,故推測其在芒果中編碼GGPPS大亞基,因此命名為MinGGPPSlsu。基因結(jié)構(gòu)分析表明,MinGGPPSlsu沒有內(nèi)含子。構(gòu)建亞細(xì)胞定位質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過實(shí)時共聚焦顯微鏡觀察該基因定位于葉綠體。采用RACE技術(shù),從芒果果肉中克隆了GGPP 基因,其cDNA理論全長為1298bp,開放閱讀框全長為1005bp,編碼333個氨基酸。與近緣物種印楝GGPPSssu(KM108317)氨基酸序列同源性為83%,該基因氨基酸序列含有一個DDx(2-4)D保守基元和一個CxxxC基元,聚類時此基因與其它物種的GGPPS小亞基聚在一個顯著的獨(dú)立枝,故推測其在芒果中編碼GGPPS小亞基,因此命名為MinGGPPSssu;蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,MinGGPPSssu有515bp的內(nèi)含子。構(gòu)建亞細(xì)胞定位質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過實(shí)時共聚焦顯微鏡觀察該基因定位于葉綠體。2.選擇金煌、貴妃、椰香、紅玉和臺農(nóng)的未熟果和成熟果為材料,通過基因表達(dá)量和總類胡蘿卜素的測定,結(jié)果表明這5個品種的成熟果果肉中MinGGPPSlsu的表達(dá)量和總類胡蘿卜素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未熟果果肉。以成熟果果肉顏色差異較大的紅玉和椰香的成熟過程的6個階段的果肉為實(shí)驗(yàn)材料,通過基因表達(dá)量和類胡蘿卜素的測定與相關(guān)性分析,結(jié)果表明兩個品種的6個階段的MinGGPPSlsu的表達(dá)量與總類胡蘿卜素的含量顯著正相關(guān),MinGGPPSssu的表達(dá)量與類胡蘿卜素的含量不相關(guān)。暗示MinGGPPSlsu在果肉后熟過程中參與類胡蘿卜素的合成,其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。3.椰香果實(shí)成熟過程中果肉顏色由白轉(zhuǎn)橙,紅玉果實(shí)成熟過程中果肉顏色由白轉(zhuǎn)黃。通過高效液相色譜法對β-胡蘿卜素和番茄紅素檢測,結(jié)果如下:椰香和紅玉果實(shí)成熟過程的六個階段果肉中的β-胡蘿卜素均呈上升趨勢且與MinGGPPSlsu表達(dá)量正相關(guān),同階段椰香果肉中的β-胡蘿卜素普遍高于紅玉;椰香在階段5和6檢測到番茄紅素,紅玉中沒有檢測到番茄紅素。本研究初步揭示了 GGPPS基因?qū)笫爝^程中果肉類胡蘿卜素積累的影響。通過對芒果GGPPS的研究為果肉類胡蘿卜素的積累提供實(shí)驗(yàn)支持,并為生產(chǎn)上芒果果實(shí)成熟期與類胡蘿卜素等烯萜類物質(zhì)的調(diào)控提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】:海南大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位年份】:2017
【中圖分類】:S667.7
【部分圖文】:

引物,片段,粘性末端,互補(bǔ)序列


圖2-4:設(shè)計(jì)片段擴(kuò)增引物??Fig2-4:?Design?of?fragment?amplification?primers??注:5’端的N代表任意堿基。方框里為任意選擇的粘性末端。紅字為gRNA片段的反向互補(bǔ)序列。??3’末端小寫字母為退火gRNA正向引物或者tRNA反向引物。??Note:?The?t'vo?5’-terminal?bases?(shown?in?lowercase)?are?randomly?added?nucleotides?to?enhance?Bsal??digestion?of?PCR?products.?The?red?color?indicates?the?reverse?complementary?sequence?to?the?spacer.??The?lowercase?letters?at?the?3’ ̄end?indicate?bases?that?anneal?to?gRNA?(Forward?primer)?or?tRNA??

示意圖,靶點(diǎn),基因,示意圖


圖2-3:?GGP/5基因編輯靶點(diǎn)示意圖??Fig2-3:?Diagram?of?GGPPS?gene?editing?target??表外顯子,細(xì)線代表內(nèi)含子序列,剪刀符號為所選靶點(diǎn)依次為1-8??tliick?line?represents?exons,?and?tlie?thin?line?represents?intron.?and?the?scissors?lie?selected?target?from?1?to?8??

標(biāo)準(zhǔn)曲線,胡蘿卜素,線性回歸方程,標(biāo)準(zhǔn)曲線


為30°C;進(jìn)液量為2〇nL;梯度洗脫條件為0mm30°/。流動相B,?10min30%,?20min90%流動相?B,?25min30%流動相?B。??(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線??。保埃恚绲内啵}卜素標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮定容到100mL,配成100|xg/mL的母液。的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯定容到20mL,配成2〇ng/mL的母液。使用MT標(biāo)準(zhǔn)品。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2-1和2-2所示范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程和檢出限如表1所示。??表1番茄紅素和P-胡蘿卜素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限??Table?1?Linear,?correlation,?coefficient,?Detection?limit?of?lycopene?and?((-carotene??線性范圍?相關(guān)系數(shù)?檢出限??類胡蘿卜素?回歸方程?竹人1?乂?T/.??(^g/inL)?(R2)?(jig/mL)??P-胡蘿卜素?9-73?y?=?228.61x?+87.458?0.9996?0.01??番茄紅素?1-20?y?=?247.22x+?10.555?0.9991?0.02??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號:2892065

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