芒果果肉中含有類胡蘿卜素、葉綠素等烯萜類物質(zhì),它們賦予了芒果豐富的營養(yǎng)價值和果實(shí)顏色。香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPPS)是類胡蘿卜素等烯萜類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵限速酶,其產(chǎn)物GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)是類胡蘿卜素等下游代謝物質(zhì)的共同前體。本研究以金煌、貴妃、椰香、紅玉和臺農(nóng)的果肉為研究材料,采用生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù),研究GGPPS基因?qū)笫爝^程中果肉類胡蘿卜素積累的調(diào)控機(jī)制。取得以下研究結(jié)果。1.采用RACE技術(shù),從芒果果肉中克隆了 GGPPS基因,其cDNA理論全長為1247 bp,開放閱讀框全長為1113bp,編碼369個氨基酸。該基因與薔薇GGPPS(AAM21639.1)氨基酸序列同源性為78%,氨基酸序列分析表明該序列含有兩個DDx(2-4)D保守基元(FARM和SARM)和一個CxxxC基元,聚類結(jié)果表明此基因與其它物種的GGPPS大亞基聚在一起,故推測其在芒果中編碼GGPPS大亞基,因此命名為MinGGPPSlsu。基因結(jié)構(gòu)分析表明,MinGGPPSlsu沒有內(nèi)含子。構(gòu)建亞細(xì)胞定位質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過實(shí)時共聚焦顯微鏡觀察該基因定位于葉綠體。采用RACE技術(shù),從芒果果肉中克隆了GGPP 基因,其cDNA理論全長為1298bp,開放閱讀框全長為1005bp,編碼333個氨基酸。與近緣物種印楝GGPPSssu(KM108317)氨基酸序列同源性為83%,該基因氨基酸序列含有一個DDx(2-4)D保守基元和一個CxxxC基元,聚類時此基因與其它物種的GGPPS小亞基聚在一個顯著的獨(dú)立枝,故推測其在芒果中編碼GGPPS小亞基,因此命名為MinGGPPSssu�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,MinGGPPSssu有515bp的內(nèi)含子。構(gòu)建亞細(xì)胞定位質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過實(shí)時共聚焦顯微鏡觀察該基因定位于葉綠體。2.選擇金煌、貴妃、椰香、紅玉和臺農(nóng)的未熟果和成熟果為材料,通過基因表達(dá)量和總類胡蘿卜素的測定,結(jié)果表明這5個品種的成熟果果肉中MinGGPPSlsu的表達(dá)量和總類胡蘿卜素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未熟果果肉。以成熟果果肉顏色差異較大的紅玉和椰香的成熟過程的6個階段的果肉為實(shí)驗(yàn)材料,通過基因表達(dá)量和類胡蘿卜素的測定與相關(guān)性分析,結(jié)果表明兩個品種的6個階段的MinGGPPSlsu的表達(dá)量與總類胡蘿卜素的含量顯著正相關(guān),MinGGPPSssu的表達(dá)量與類胡蘿卜素的含量不相關(guān)。暗示MinGGPPSlsu在果肉后熟過程中參與類胡蘿卜素的合成,其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。3.椰香果實(shí)成熟過程中果肉顏色由白轉(zhuǎn)橙,紅玉果實(shí)成熟過程中果肉顏色由白轉(zhuǎn)黃。通過高效液相色譜法對β-胡蘿卜素和番茄紅素檢測,結(jié)果如下:椰香和紅玉果實(shí)成熟過程的六個階段果肉中的β-胡蘿卜素均呈上升趨勢且與MinGGPPSlsu表達(dá)量正相關(guān),同階段椰香果肉中的β-胡蘿卜素普遍高于紅玉;椰香在階段5和6檢測到番茄紅素,紅玉中沒有檢測到番茄紅素。本研究初步揭示了 GGPPS基因?qū)笫爝^程中果肉類胡蘿卜素積累的影響。通過對芒果GGPPS的研究為果肉類胡蘿卜素的積累提供實(shí)驗(yàn)支持,并為生產(chǎn)上芒果果實(shí)成熟期與類胡蘿卜素等烯萜類物質(zhì)的調(diào)控提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S667.7
【部分圖文】：

圖２－４：設(shè)計(jì)片段擴(kuò)增引物??Ｆｉｇ２－４：?Ｄｅｓｉｇｎ?ｏｆ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｉｍｅｒｓ??注：５’端的Ｎ代表任意堿基。方框里為任意選擇的粘性末端。紅字為ｇＲＮＡ片段的反向互補(bǔ)序列。??３’末端小寫字母為退火ｇＲＮＡ正向引物或者ｔＲＮＡ反向引物。??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｔ＇ｖｏ?５’－ｔｅｒｍｉｎａｌ?ｂａｓｅｓ?（ｓｈｏｗｎ?ｉｎ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ）?ａｒｅ?ｒａｎｄｏｍｌｙ?ａｄｄｅｄ?ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ?ｔｏ?ｅｎｈａｎｃｅ?Ｂｓａｌ??ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ．?Ｔｈｅ?ｒｅｄ?ｃｏｌｏｒ?ｉｎｄｉｃａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｒｅｖｅｒｓｅ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｓｐａｃｅｒ．??Ｔｈｅ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ?ｌｅｔｔｅｒｓ?ａｔ?ｔｈｅ?３’￣ｅｎｄ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｂａｓｅｓ?ｔｈａｔ?ａｎｎｅａｌ?ｔｏ?ｇＲＮＡ?（Ｆｏｒｗａｒｄ?ｐｒｉｍｅｒ）?ｏｒ?ｔＲＮＡ??

圖２－３：?ＧＧＰ／５基因編輯靶點(diǎn)示意圖??Ｆｉｇ２－３：?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＧＧＰＰＳ?ｇｅｎｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｔａｒｇｅｔ??表外顯子，細(xì)線代表內(nèi)含子序列，剪刀符號為所選靶點(diǎn)依次為１－８??ｔｌｉｉｃｋ?ｌｉｎｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｅｘｏｎｓ，?ａｎｄ?ｔｌｉｅ?ｔｈｉｎ?ｌｉｎｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｉｎｔｒｏｎ．?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｓｃｉｓｓｏｒｓ?ｌｉｅ?ｓｅｌｅｃｔｅｄ?ｔａｒｇｅｔ?ｆｒｏｍ?１?ｔｏ?８??

為３０°Ｃ；進(jìn)液量為２〇ｎＬ；梯度洗脫條件為０ｍｍ３０°／。流動相Ｂ，?１０ｍｉｎ３０％，?２０ｍｉｎ９０％流動相?Ｂ，?２５ｍｉｎ３０％流動相?Ｂ。??（３）標(biāo)準(zhǔn)曲線??�。保埃恚绲内啵}卜素標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮定容到１００ｍＬ，配成１００｜ｘｇ／ｍＬ的母液。的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯定容到２０ｍＬ，配成２〇ｎｇ／ｍＬ的母液。使用ＭＴ標(biāo)準(zhǔn)品。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖２－１和２－２所示范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程和檢出限如表１所示。??表１番茄紅素和Ｐ－胡蘿卜素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限??Ｔａｂｌｅ?１?Ｌｉｎｅａｒ，?ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，?ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｌｉｍｉｔ?ｏｆ?ｌｙｃｏｐｅｎｅ?ａｎｄ?（（－ｃａｒｏｔｅｎｅ??線性范圍?相關(guān)系數(shù)?檢出限??類胡蘿卜素?回歸方程?竹人１?乂?Ｔ／．??（＾ｇ／ｉｎＬ）?（Ｒ２）?（ｊｉｇ／ｍＬ）??Ｐ－胡蘿卜素?９－７３?ｙ?＝?２２８．６１ｘ?＋８７．４５８?０．９９９６?０．０１??番茄紅素?１－２０?ｙ?＝?２４７．２２ｘ＋?１０．５５５?０．９９９１?０．０２??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2892065