梨重組S-RNase蛋白對花粉管生長的影響及花粉SFBBs基因的挖掘
【學(xué)位單位】:揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位年份】:2019
【中圖分類】:S661.2
【部分圖文】:
.以鴨梨花柱cDNA為模板,分別擴增了幻(AY250989.3?)和??(DQ414813.1)的CDS區(qū)域。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,兩個基因的大小在750bp附近,??合預(yù)期大小,且均為單一特異性條帶(圖3-1)。將兩個條帶分別回收純化之后,與載體??粒pCold-TF同時進行雙酶切并分別回收純化片段。將目的片段分別與pCold-TF載體連??轉(zhuǎn)化后,在Amp抗性平板上挑選菌落。每個重組質(zhì)粒挑選單克隆進行驗證,其中空載菌??約為250?bp,而正確連接的單克隆約為1?kb左右。如圖3.1所示,幻M此的重組質(zhì)??中共有3個陽性克隆,幻的重組質(zhì)粒有4個陽性克隆。??為了避免假陽性,分別挑選兩個陽性克隆過夜搖菌,提取質(zhì)粒后進行雙酶切驗證,以??Cold-TF環(huán)狀質(zhì)粒作陽性對照。凝膠圖約為5.8?kb位置為酶切過的載體質(zhì)粒,750?bp附近??目的條帶大小。四個質(zhì)粒都切出了兩個條帶,上方條帶與質(zhì)粒DNA大小相當,下方條??大小與PCR產(chǎn)物大小相一致,說明這些質(zhì)粒都已經(jīng)被正確構(gòu)建。將篩選的陽性克隆送至??工生物公司進行sanger測序,測序結(jié)果經(jīng)過對比,與NCB丨中登陸的幻的??DS區(qū)域完全匹配,可以進行下一步的原核表達。??
250bp??(c)??圖2.1?521-RNase和S34-RNase的重組質(zhì)粒構(gòu)建??(a):?621/534-RNaseCDS區(qū)域PCR產(chǎn)物;(b):重組質(zhì)粒的酶切鑒定;(c):重組質(zhì)粒的PCR篩選。??M:?MarkerD2000?(Tiangen);?S21:?S21-RNase;?S34:?S34-RNase??Figure?2.1?Construction?of?recombinant?plasmids?for?.S21-RNase?and?534-RNase.?(a):?PCR?product?of??S21-RNase?and?S34-RNase?CDS?regions;?(b):?restriction?enzyme?digestion?of?recombinant?plasmids;?(c):?PCR??screening?of?recombinant?plasmids.?M:?Marker?D2000?(Tiangen);?S21:?S21-RNase;?34:?S34-RNase??
然后使用40?mM濃度的咪唑?qū)Ψ翘禺愋晕降碾s蛋白進行洗滌,并使用250??mM濃度的咪唑進行洗脫收集。??從圖2.4中可以看出,泳道1和2以及泳道4和5中的蛋白雜帶很多,雖然含有一定??量的目的蛋白,但從洗脫的情況(泳道3和泳道6)來看,目的條帶較為清晰明亮,且雜??蛋白濃度遠遠低于目的蛋白?蓪⑾疵摰牡鞍走M行脫鹽、濃縮,并用甘油保存重組gRNase??蛋白。??
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本文編號:2890599
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