植物中可溶性糖——包括蔗糖、葡萄糖和果糖,不僅作為信號(hào)物質(zhì)調(diào)控著成千上萬(wàn)基因的表達(dá),影響著植物生長(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)逆境的抗性,也調(diào)控著胞內(nèi)滲透勢(shì)、膨壓和氧化還原勢(shì),且可溶性糖的種類(lèi)和組成也會(huì)影響蘋(píng)果等水果的品質(zhì)。蘋(píng)果作為薔薇科代表果樹(shù),由于其長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)耐镆陨嚼娲紴橹?山梨醇在庫(kù)細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)化為果糖進(jìn)入碳代謝。因此,與其它植物相比,蘋(píng)果中具有更高效的果糖利用能力。探明蘋(píng)果中果糖高效代謝利用的調(diào)控機(jī)制,對(duì)于果實(shí)品質(zhì)的改良和生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有重要意義。為此,本文結(jié)合蘋(píng)果基因組篩選了在庫(kù)細(xì)胞中高度表達(dá)的果糖代謝相關(guān)的果糖激酶基因MdFRK2,研究了其表達(dá)及催化特性,獲得了轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果等,研究了其在糖代謝調(diào)控中的功能。獲得的主要結(jié)果如下:1.在蘋(píng)果基因組中共鑒定到了12個(gè)MdFRK同源基因,其中MdFRK2與番茄高親和力果糖激酶LeFRK2親緣關(guān)系最近,其ORF全長(zhǎng)990bp,編碼330個(gè)氨基酸,屬于pfkB家族,并且含有FRK特有的糖結(jié)合域和ATP結(jié)合域。表達(dá)分析顯示,MdFRK2基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,在蘋(píng)果莖尖、幼果等代謝活躍的庫(kù)器官中高度表達(dá),與果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果糖的含量呈顯著負(fù)相關(guān)。為研究其催化特性,純化獲得了在大腸桿菌中異源表達(dá)的MdFRK1和MdFRK2蛋白,活性分析表明,二者對(duì)果糖有高度的底物特異性,且活性受高濃度果糖的反饋抑制。對(duì)其動(dòng)力學(xué)酶活性研究發(fā)現(xiàn),MdFRK2蛋白(Km=0.1 mm)對(duì)果糖的親和力顯著高于MdFRK1蛋白(Km=0.62 mm),但二者有相似的最大催化活性。這些結(jié)果表明,蘋(píng)果中果糖的高效利用與MdFRK2的高度表達(dá)及對(duì)果糖高的催化能力有關(guān)。2.為了證實(shí)MdFRK2基因?qū)μO(píng)果果糖含量及糖代謝路徑的影響,構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化‘嘎啦’蘋(píng)果,經(jīng)分子和酶活性鑒定,獲得了3個(gè)MdFRK2基因過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株,其MdFRK2的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào),且FRK酶活性增加。在培養(yǎng)箱種植的3月齡的轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率和生長(zhǎng)與野生型無(wú)明顯區(qū)別。對(duì)糖含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果苗葉片中不僅果糖含量顯著降低,且葡萄糖、蔗糖的含量均低于野生型植株。對(duì)其蔗糖含量下降原因的研究表明,轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果中果糖代謝加快后,山梨醇合成關(guān)鍵酶A6PR及代謝的關(guān)鍵酶SDH酶活顯著增加,而蔗糖合成關(guān)鍵酶SPS及代謝關(guān)鍵酶NINV和SUSY酶活顯著降低,導(dǎo)致蔗糖和葡萄糖含量降低。這些結(jié)果表明MdFRK2基因調(diào)控蘋(píng)果中果糖的含量,且蘋(píng)果葉片能通過(guò)改變山梨醇和蔗糖代謝調(diào)控糖的含量。同時(shí),對(duì)MdFRK2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄的研究也表明,MdFRK2過(guò)表達(dá)增加了番茄果實(shí)中FRK的活性,降低了果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。3.由于MdFRK2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果中的糖含量變化趨勢(shì)與褪黑素處理的苗子中糖含量變化趨勢(shì)相反,我們推測(cè)MdFRK2表達(dá)與褪黑素信號(hào)之間存在密切的關(guān)聯(lián)。為探明FRK2表達(dá)與褪黑素介導(dǎo)的糖積累之間的關(guān)系,我們用褪黑素處理野生型和MdFRK2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果苗。研究發(fā)現(xiàn),高濃度褪黑素處理后,野生型蘋(píng)果苗葉片中MdFRK2的轉(zhuǎn)錄和FRK活性受到抑制,果糖、葡萄糖和蔗糖含量顯著增加,苗子生長(zhǎng)受到抑制。在煙草葉片中瞬時(shí)轉(zhuǎn)化MdFRK2基因啟動(dòng)子也證實(shí)MdFRK2的表達(dá)受高濃度褪黑素的抑制。但高濃度的外源褪黑素處理MdFRK2轉(zhuǎn)基因苗并不能引起葉片中果糖、葡萄糖及蔗糖的大量積累,苗子的生長(zhǎng)也沒(méi)有受到明顯抑制。以上結(jié)果表明MdFRK2基因表達(dá)參與了高濃度褪黑素介導(dǎo)的糖積累和生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。4.將培養(yǎng)箱中的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果小苗移栽至溫室一年后,再次測(cè)定糖含量發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果苗葉片中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量不但沒(méi)有下降,反而顯著升高。進(jìn)一步分析表明,轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果葉片中MdFRK2表達(dá)仍然增加了24-45倍,但FRK活性表現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢(shì),參與糖代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)(如MdSDH1,MdSPS1,MdSUSY2)和酶活性(如SDH,SPS和SUSY)表現(xiàn)出與幼苗期完全相反的變化趨勢(shì)。這些結(jié)果表明MdFRK2蛋白發(fā)生了翻譯后修飾,且進(jìn)一步證實(shí)了由MdFRK2決定的FRK活性調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)的糖信號(hào)以及代謝。我們通過(guò)高通量測(cè)序?qū)D(zhuǎn)基因蘋(píng)果中果糖恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果中存在的差異表達(dá)基因共477個(gè),包括41個(gè)蛋白質(zhì)水平調(diào)控相關(guān)的基因,這些蛋白功能的進(jìn)一步解析有望探明蘋(píng)果中果糖信號(hào)的調(diào)控機(jī)制。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S661.1
【部分圖文】：

FRKs 可能和植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。在玉米中，短期的鹽 FRK2 基因表達(dá)上調(diào)（Zorb et al. 2010）；在向日葵中，干旱脅迫導(dǎo)致 FRK 蛋謝相關(guān)的蛋白表達(dá)共同上調(diào)（Fulda et al. 2011）；甜菜根中，F(xiàn)RK 活性隨著長(zhǎng)而增加（Klotz et al. 2006）；在缺氧的條件下，水稻的兩個(gè) FRK 同工酶卻活性，其中 OsFRK2 表達(dá)上調(diào)，但是 OsFRK1 表達(dá)下調(diào)（Guglielminetti et al. 2（2016）研究山梨醇和蔗糖在蘋(píng)果抵抗干旱脅迫中的作用發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下中與糖代謝有關(guān)的大部分基因表達(dá)量上調(diào)，其中包括 MdFRK2 基因。 蘋(píng)果中糖代謝研究進(jìn)展.1 蘋(píng)果糖代謝特點(diǎn)蘋(píng)果中光合產(chǎn)物主要以山梨醇形式存在，約占總光合產(chǎn)物的 80%左右，其次約占總光合產(chǎn)物的 20%（圖 1-1）。這兩種物質(zhì)在源葉中合成后，一部分用于所需的碳骨架，一部分作為代謝底物被氧化分解提供能量，其余大部分通過(guò)管-伴胞復(fù)合體運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)、莖尖等庫(kù)器官中進(jìn)行代謝（圖 1-2，鄧麗莉和生; Li et al. 2016）。

圖 1-2 蘋(píng)果庫(kù)器官中的糖代謝及利用途徑（Li et al. 2012）Fig. 1-2 Metabolism and utilization of carbohydrate in apple fruit.醇代謝山梨醇廣泛存在于葉片、葉柄、韌皮部、莖、根、種子和果實(shí)其在成熟葉片中含量非常高，而在果實(shí)中含量遠(yuǎn)低于葉片，僅Josef 2004）。葉片中高的山梨醇含量有利于向果實(shí)中的轉(zhuǎn)運(yùn)，果葡萄糖濃度是由于葉片中山梨醇的轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致（梁東 2010）。光合碳代謝形成的磷酸丙糖被位于葉綠體被膜上的磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并經(jīng)過(guò)幾種酶解后生成果糖-1,6-二磷酸（FBP），胞質(zhì)中的FBPase）催化果糖-1,6-二磷酸分解為 6-磷酸果糖（Fructose-6-p酸。6-磷酸果糖可逆的轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖（Gucrose-6-phospha糖在 6- 磷酸山梨醇脫氫酶（ S6PDH ）的催化下生成 6- 磷phosphate，S6P），而后經(jīng) 6-磷酸山梨醇磷酸酯酶（Sorbitol-6SorPP）脫磷生成山梨醇（梁東 2010; Zhou et al. 2004; Aprea et a成的大部分山梨醇經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)綆?kù)器官中進(jìn)行卸載。在蘋(píng)

9 MdFRK 蛋白活性檢測(cè)測(cè)定方法參照 Renz（1993），1 ml 的反應(yīng)體系包括 50 mM Tris-HCl（pH 8.0MgCl2， 2.5 mM ATP ， 0.33 mM NAD+， 1 U G6P dehydrogenase ，phoglucoisomerase，25 μL 純化蛋白，最后加入 200 ul 不同濃度（0-8 mM）的反應(yīng)。30℃水浴 5 min，340 nm 下測(cè)定吸光值。 結(jié)果與分析1 MdFRK2 基因的克隆和序列分析利用前人報(bào)道的番茄 LeFRK2 序列在蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，與其同源度列編號(hào)為 MD04G1042400。據(jù)此，本試驗(yàn)克隆了 MD04G1042400 的開(kāi)放閱RF），命名為 MdFRK2。通過(guò) DNAMAN 軟件將測(cè)序結(jié)果與蘋(píng)果基因組中預(yù)序列進(jìn)行核酸序列比對(duì)，其一致性高達(dá) 95.93%，表明克隆到的基因即為正RK2 基因（圖 2-1）。MdFRK2 基因的 ORF 全長(zhǎng) 990 bp，編碼 330 個(gè)氨基酸殘?zhí)O果基因組的第 0 號(hào)染色體上，含有 4 個(gè)外顯子和 3 個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng) 3124 b。
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本文編號(hào)：2890218