黃瓜(Cucumis sativus L.)反季節(jié)栽培時(shí)經(jīng)常遭遇低溫脅迫,研究其低溫響應(yīng)機(jī)制將有助于創(chuàng)制黃瓜耐低溫栽培和育種的新方法。積累棉籽糖家族寡糖(RFOs)是植物抵御低溫脅迫的有效途徑之一,前期研究表明,黃瓜作為一種RFOs運(yùn)輸型植物,低溫同樣會(huì)導(dǎo)致RFOs在葉片中積累,低溫解除后RFOs含量又逐步恢復(fù)至正常水平。但是,在低溫脅迫與解除過(guò)程中,RFOs合成與分解的生理過(guò)程并不清楚。水蘇糖合成酶(STS,EC.2.4.1.67)和α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)分別是催化水蘇糖合成與分解的關(guān)鍵酶。黃瓜葉片中存在3種不同的STS轉(zhuǎn)錄本和6種不同的α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)錄本,其中各STS轉(zhuǎn)錄本由同一基因編碼、通過(guò)選擇性剪切生成;而各α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)錄本則是由6個(gè)不同的基因所編碼。在低溫脅迫與解除過(guò)程中,這些轉(zhuǎn)錄本在RFOs合成與降解中的具體作用目前不清楚。為此,本試驗(yàn)首先建立了特異鑒定3種STS轉(zhuǎn)錄本的方法,探明了這3種轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性及其受胞內(nèi)糖水平調(diào)節(jié)表達(dá)的特點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上研究了 STS與α-半乳糖苷酶各種轉(zhuǎn)錄本在黃瓜低溫脅迫與解除過(guò)程中的表達(dá)、酶活性及相關(guān)糖含量的變化。此外,前期研究表明黃瓜低溫脅迫后RFOs在液胞、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體中均有積累,低溫解除后各亞細(xì)胞空間中的RFOs水平均逐步下降至正常水平。為探索各亞細(xì)胞空間中的RFOs分別由哪種α-半乳糖苷酶分解,本實(shí)驗(yàn)還研究了各種α-半乳糖苷酶亞細(xì)胞定位。所得結(jié)果如下:1.本試驗(yàn)建立的“3堿基錨定引物法”可特異鑒定3種STS轉(zhuǎn)錄本,保證在實(shí)時(shí)熒光RT—PCR反應(yīng)中特異地區(qū)分3種轉(zhuǎn)錄本,為后續(xù)研究提供了有效實(shí)驗(yàn)手段。2.黃瓜愈傷組織STS的表達(dá)豐度顯著低于葉片。黃瓜愈傷組織轉(zhuǎn)至無(wú)糖MS培養(yǎng)基后,3種STS轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量上升;將愈傷組織從無(wú)糖培養(yǎng)基再轉(zhuǎn)入蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、半乳糖為碳源的MS培養(yǎng)基中,3種STS轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量下降;表明STS各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)糖水平的調(diào)節(jié)。放線菌素D抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,STS Ⅱ轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性顯著低于其他2種轉(zhuǎn)錄本。3.黃瓜葉片中STSⅠ、STS Ⅱ的表達(dá)豐度顯著高于STS Ⅲ,在黃瓜低溫適應(yīng)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。4℃低溫脅迫后,黃瓜葉片中各可溶性糖含量上升,3種STS轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào),酶活性提高。結(jié)合愈傷組織的研究結(jié)果,表明該上調(diào)確為低溫所誘導(dǎo),而不是糖水平上升所導(dǎo)致�；謴�(fù)至常溫后,各可溶性糖含量下降,酸性α-半乳糖苷酶3基因(GAL3)、堿性α-半乳糖苷酶2和3基因(AGA2,AGA3 的表達(dá)上調(diào),GAL和AGA活性上升,表明這3個(gè)基因在溫度恢復(fù)后RFOs降解過(guò)程中起重要作用。4.亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明,GAL1與GAL2定位于細(xì)胞壁;GAL3主要分布于液胞;AGA1和AGA2主要分布于細(xì)胞質(zhì);AGA3則定位于葉綠體。結(jié)合前期研究結(jié)果,表明低溫解除后,GAL3、AGA2,AGA3分別在液胞、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中起降解RFOs的作用。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S642.2
【部分圖文】：

‘?：；??圖２．２?５ＴＳ質(zhì)粒ＤＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ?２．２?ＳＴＳ?ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ??注：ｈ?５７＾／質(zhì)粒ＤＮＡ；?２：?５Ｔ５７／質(zhì)粒ＤＮＡ；?３：?５７５／／／質(zhì)粒ＤＮＡ；??Ｎｏｔｅ：?１：?５７５／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?２：?５Ｔ５／／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?３：?ＳＴＳ?ＩＩＩ?ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ??２．２．１．２水蘇糖合成酶質(zhì)粒ＤＮＡ線性化??由圖２．３可知，水蘇糖合成酶質(zhì)粒經(jīng)５＾１單酶切，所得條帶與預(yù)期大�。ǎ叮埃担担�?６１２０，??６１９２）接近，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。??姻??圖２．３水蘇糖合成酶質(zhì)粒線性化??Ｆｉｇ?２．３?Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ??Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ分子量；１：未酶切質(zhì)粒ＤＮＡ；?２：?ＳＴＳ／質(zhì)粒酶切；３：?ＳｒＳ／／質(zhì)粒酶切；４：?５ＴＳ／／／??質(zhì)粒酶切??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?Ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ；?２：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?／；?３：?Ｓｉｎｇｌｅ??ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩ；?４：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩＩ??２．２．１．３體外轉(zhuǎn)錄??參照?Ｔ７?ＲｉｂｏＭＡＸ？?Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｌａｒｇｅ?Ｓｃａｌｅ?ＲＮＡ?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?Ｓｙｓｔｅｍ?（?Ｐｒｏｍｅｇａ）說(shuō)明書(shū)，??得到沉？／、５ＴＯ／／、見(jiàn)Ｓ／／／效好較好

Ｎｏｔｅ：?１：?５７５／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?２：?５Ｔ５／／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?３：?ＳＴＳ?ＩＩＩ?ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ??２．２．１．２水蘇糖合成酶質(zhì)粒ＤＮＡ線性化??由圖２．３可知，水蘇糖合成酶質(zhì)粒經(jīng)５＾１單酶切，所得條帶與預(yù)期大�。ǎ叮埃担担�?６１２０，??６１９２）接近，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。??姻??圖２．３水蘇糖合成酶質(zhì)粒線性化??Ｆｉｇ?２．３?Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ??Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ分子量；１：未酶切質(zhì)粒ＤＮＡ；?２：?ＳＴＳ／質(zhì)粒酶切；３：?ＳｒＳ／／質(zhì)粒酶切；４：?５ＴＳ／／／??質(zhì)粒酶切??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?Ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ；?２：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?／；?３：?Ｓｉｎｇｌｅ??ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩ；?４：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩＩ??２．２．１．３體外轉(zhuǎn)錄??參照?Ｔ７?ＲｉｂｏＭＡＸ？?Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｌａｒｇｅ?Ｓｃａｌｅ?ＲＮＡ?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?Ｓｙｓｔｅｍ?（?Ｐｒｏｍｅｇａ）說(shuō)明書(shū)，??得到沉？／、５ＴＯ／／、見(jiàn)Ｓ／／／效好較好，無(wú)ＲＮＡ降解現(xiàn)象發(fā)生，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)純度均在??１．８－２．２

２．２．２實(shí)時(shí)逄＿錨定引物特異性驗(yàn)證??２．２．２．１?＊ＳＴ５７反轉(zhuǎn)錄引物的特異性驗(yàn)證??由圖２．４可知，以沿＾／／為模板，以＊ｓｒｓ／－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用＊ＳＪ１Ｓ熒光定量引物進(jìn)行??ＰＣＲ，無(wú)條帶；以燈以／／為模板，以ＳｒＳＺ－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用見(jiàn)？熒光定量引物進(jìn)行ＰＣＲ，??無(wú)條帶；以燈Ｓ／為模板，以Ｗ－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量引物進(jìn)行ＰＣＲ，有條??帶且與預(yù)期大小一致（ｉ５８ｂＰ）。由此可證明引物■ｓｒｓｙ－Ｒ的特異性。??２５〇－??圖２．４?反轉(zhuǎn)錄引物的特異性驗(yàn)證??Ｆｉｇ．２．４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＳＴＳ?１?ＲＴ－ｐｒｉｍｅｒ??注：Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ分子量；１：?ＳｒＳ／Ｊ為模板；２：?Ｓｒａ／／／為模板；３：?為模板??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＳＴＳ?ＩＩ?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ；?２：?ＳＴＳ?ＩＩＩ?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ；?３：?ＳＴＳ?／?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ??２．２．２．２?＾７３７／反轉(zhuǎn)錄引物特異性驗(yàn)證??由圖２．５可知，以ｓｒｓ／為模板，以■Ｓ７１Ｓ／／－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用ｓｒｓ熒光定量引物進(jìn)行??ＰＣＲ，無(wú)條帶；以ｓｒａ／／／為模板，以Ｓ；ＴＳ／／－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用■ＳＨ熒光定量引物進(jìn)行??ＰＣＲ，無(wú)條帶；以Ｓｒａ／／為模板，以見(jiàn)Ｓ／／－Ｒ為引物反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量引物進(jìn)行ＰＣＲ，??有條帶且與預(yù)期大小一致（１５８ｂｐ）。可證明引物Ｓ７Ｓ／／－Ｒ的特異性。??Ｍ?１?２?３??遽Ｓ１終麗，??
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