干巴菌(Thelephora ganbajun Zang),屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌屬(Thelephora),是云南省珍稀的野生食用菌,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前對(duì)于干巴菌的報(bào)道大多集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、干巴菌成分的分析、遺傳差異以及生態(tài)效應(yīng)方面,對(duì)于干巴菌基因和生長(zhǎng)機(jī)理方面的研究甚少。本研究主要運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來(lái)測(cè)定干巴菌生長(zhǎng)的不同土壤深度和范圍的菌絲體含量,從而探究干巴菌的生長(zhǎng)和子實(shí)體形成機(jī)理。通過(guò)對(duì)干巴菌單拷貝基因和多拷貝基因測(cè)定土壤菌絲體含量的比較,探討單拷貝基因和多拷貝基因測(cè)定土壤菌絲體的優(yōu)缺點(diǎn)和可行性。本研究應(yīng)用多拷貝基因?qū)崟r(shí)定量PCR方法對(duì)云南常見的外生菌根真菌銅綠菌(Lactarius hatsudake)進(jìn)行了土壤菌絲體含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)干巴菌與銅綠菌在子實(shí)體形成過(guò)程中土壤的菌絲體含量及分布存在一定的差異性。本研究得出的主要結(jié)果如下:1、目前現(xiàn)有的單拷貝基因引物主要針對(duì)口蘑屬,本研究摸索了其引物對(duì)干巴菌DNA的擴(kuò)增,結(jié)果沒有獲得單一條帶和有效序列,因此現(xiàn)有單拷貝基因引物不適用于干巴菌單拷貝基因的擴(kuò)增。本研究通過(guò)基因組比較,找到了干巴菌的單拷貝基因,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了特異性引物;通過(guò)比對(duì)銅綠菌與相近物種的ITS序列設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了特異性引物。上述兩對(duì)特異性引物的成功合成,為土壤中菌絲體含量的實(shí)時(shí)定量測(cè)定提供可實(shí)施的必要條件。2、多拷貝基因與單拷貝基因?qū)崟r(shí)定量PCR測(cè)定方法的結(jié)果有成倍增加和減少的趨勢(shì)大體一致,但也存在一定的差異。兩種基因測(cè)得的干巴菌菌絲體含量,比值在1-29之間。少量樣品比值差異性較大,倍數(shù)在1-3左右,而比值在5-16之間的占總數(shù)的57.14%。如果測(cè)定干巴菌菌絲體含量用來(lái)研究干巴菌菌絲體的分布狀況,也可以考慮使用多拷貝基因來(lái)測(cè)定作為參考。3、根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定土壤菌絲體含量分析比較發(fā)現(xiàn)銅綠菌與干巴菌子實(shí)體形成的過(guò)程存在較大差異,土壤中干巴菌菌絲體分布不具菌塘規(guī)律性,銅綠菌菌絲體在土壤中分布具有一定的規(guī)律性。推斷銅綠菌在子實(shí)體形成過(guò)程中,可能其菌絲侵入植物體根部,吸收根部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),菌絲體含量逐漸增多并在土壤中逐漸向外延伸,當(dāng)土壤環(huán)境較為適合時(shí),銅綠菌菌絲體逐漸聚集增多形成菌塘,從而形成子實(shí)體。4、通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)干巴菌在子實(shí)體的形成過(guò)程中,其菌絲侵入松樹等的根部,進(jìn)入根部細(xì)胞間隙,然后向根外延伸形成二叉分支結(jié)構(gòu)的菌根,而后菌根逐漸增多聚集,聚集到一定程度時(shí)形成子實(shí)體。在此過(guò)程中有少量菌絲體分散在土壤中,但不形成菌塘。根據(jù)這一特征,在干巴菌的人工栽培過(guò)程中,可以通過(guò)提高干巴菌侵染以及控制寄主松樹的生長(zhǎng)狀況來(lái)實(shí)現(xiàn),但還需進(jìn)一步探索。
【學(xué)位單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

２．１．３瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序??�。玻蓿蹋校茫耶a(chǎn)物在２％瓊脂糖凝膠上電泳，ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒＴＭ染色，紫外透??射儀檢測(cè)見圖２。將有單一條帶的ＰＣＲ產(chǎn)物送到昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)??序，測(cè)序均未獲得有效序列，見圖２。??應(yīng)用上述物種的單拷貝基因引物，均未成功擴(kuò)增出干巴菌的相應(yīng)基因片段。??１５??

Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐａｒｔｉａｌ?ｐｒｉｍｅｒ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｉｎｇｌｅ?ｃｏｐｙ?ｇｅｎｅ?ｏｆ??Ｔｈｅｌｅｐｈｏｒａ?ｇａｎｂａｊｕｎ?Ｚａｎｇ??２．２．３干巴菌單拷貝基因的驗(yàn)證??割膠回收：準(zhǔn)備Ａ６、Ａ１４、Ａ２８、Ａ４５、Ａ５０和Ａ５１這６對(duì)引物擴(kuò)增的ＰＣＲ產(chǎn)??物，�。玻颠玻校茫覕U(kuò)增產(chǎn)物和５卟Ｕｎｌｏａｄｉｎｇ?ｂｕｆｆｅｒ混勻，２％的瓊脂糖凝膠電??泳，ＰＣＲ產(chǎn)物回收時(shí)做割膠回收。具體回收具體步驟按照從云南晨綠生物科技??有限公司購(gòu)買的天根ＤＮＡ純化回收試劑盒（貨號(hào)為：ＤＰ２１４）操作，把回收的??ＤＮＡ放到－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??ＤＮＡ片段兩端連接腺嘌呤：由于ＰＣＲ試劑金牌ＭＩＸ?cái)U(kuò)增的基因片段兩端沒有??連接腺嘌呤，回收的ＤＮＡ片段兩端需要加入腺嘌呤。反應(yīng)體系為：回收產(chǎn)物??２２??

?云南大學(xué)碩士畢業(yè)論文???的甘油溶液（按照１：?５的比例加入），固定在搖床上１８０轉(zhuǎn)３７°Ｃ培養(yǎng)１?ｈ，然??后放置于－２０＂Ｃ的冰箱中保存。??測(cè)序結(jié)果用ｓｅｑＭａｎ和ＢｉｏＥｄｉｔ軟件進(jìn)行比對(duì)，３０個(gè)插入載體中單克隆的序??列進(jìn)行比對(duì)并與之前ＰＣＲ擴(kuò)增序列及從基因組中挑選出來(lái)的原單拷貝基因序??列比對(duì)，序列完全相同的有：引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１擴(kuò)增的基因片段，??分別見圖５、圖６、圖７和圖８。因此引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１均為干??巴菌單拷貝基因特異性引物。??＊ｅ－１?Ｇ：：：．?：?：?：?ｒａｒＣ／＾．－－ＧｒＡ?■?：ＧＧ＾ｒ３＊ＣＧＡ：?；?．?：?ｒＴＣＣ：Ｃ．?；?．?Ｔ?：?Ａ?久；《〇〇：．二〇；：－．｜１＊�。簭V－－－－：ｓ：?／ＧＧ：１：??Ａ４－２?ａ．－．?Ｃ?．３．?；；Ｇ５－．．－３；．ｔ５Ｃ；．?？－?．：?Ｇ?：．?：?．?：：■：．?．?．－３；．?．?．?Ｓ３３；．?ＡＣＣ?．?Ｊ－－?ＣＡ?；?：ｒ〇．?．?Ｃ?．?３?．?．Ｃｉ．：??－－＊＊＊－＇?■￣－＇
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2874996