轉(zhuǎn)基因技術(shù)是植物基因功能研究的最有效技術(shù)之一,也是未來作物精準(zhǔn)育種的候選途徑。但是由于再生體系不成熟等因素,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大多數(shù)蔬菜作物中應(yīng)用還存在障礙。甜瓜是我國乃至全世界的重要蔬菜作物。傳統(tǒng)的甜瓜轉(zhuǎn)基因體系存在著再生效率低、嵌合體概率高等缺陷。本研究從建立高效甜瓜體細(xì)胞胚途徑再生體系入手,研究了以不同基因型甜瓜種子切塊為外植體,誘導(dǎo)愈傷組織從而萌發(fā)胚胎,最后再生為完整植株的再生體系。并在此基礎(chǔ)上,建立了基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。取得主要成果如下:1、建立了基于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的甜瓜再生體系:通過篩選激素種類和激素濃度配比,以及對十二種甜瓜基因型進(jìn)行體胚的誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)粗皮甜瓜材料'Vedrantais'在激素組合2,4-D和6-BA中誘導(dǎo)體胚效率最高,其余幾種基因型甜瓜能夠誘導(dǎo)愈傷組織形成,且愈傷組織不斷膨大,但是體細(xì)胞胚產(chǎn)生概率極低。此外,誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成最佳培養(yǎng)基配方(1L)為:MS + 30g蔗糖+ 2 mg/L 2,4-D+ 0.1mg/L6-BA,液體培養(yǎng)7-8周,再生固體培養(yǎng)基:MS + 30g蔗糖;生根培養(yǎng)基配方:MS+15g蔗糖。2、利用二元質(zhì)粒法構(gòu)建了基于pBBRacdS的超級(jí)農(nóng)桿菌:為提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜轉(zhuǎn)化效率,導(dǎo)入pBBRacdS質(zhì)粒載體,實(shí)現(xiàn)在農(nóng)桿菌工程菌中表現(xiàn)ACC脫氨酶活性,可降低農(nóng)桿菌侵染后外植體或愈傷組織細(xì)胞中乙烯含量,提高再生效率。此后,通過二元質(zhì)粒法將目標(biāo)基因CmWRKY27過表達(dá)載體經(jīng)歷兩次電轉(zhuǎn)導(dǎo)入含有pBBRacdS的根癌農(nóng)桿菌,對甜瓜進(jìn)行侵染。3、獲得了甜瓜轉(zhuǎn)基因植株:將種子切塊預(yù)培養(yǎng)兩天,用含雙載體的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行侵染后共培養(yǎng),液體選擇培養(yǎng)基:EI液體培養(yǎng)基+5mg/LHygromycin+ 25 mg/L Timentin;固體選擇培養(yǎng)基:MS + 30g 蔗糖 +15 mg/L Hygromycin +100mg/LTimentin。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化率為0.18%。該體系篩選效率高,有效節(jié)省后續(xù)鑒定工作量。本實(shí)驗(yàn)建立了基于體細(xì)胞胚途徑的甜瓜再生及轉(zhuǎn)基因體系,提高再生效率并降低嵌合體概率。有助于甜瓜的功能基因研究,為將來的甜瓜分子設(shè)計(jì)育種提供重要技術(shù)儲(chǔ)備,并為其他葫蘆科作物提供借鑒。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S652
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｍｅｌｏｎ?４ＸＬＨ，?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂｙ?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇＡ－／??激素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)５閭，移至固體培養(yǎng)基（不含激素）中１周，不斷分ｂ在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)７周后；ｃ在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)１０周后．??ｅｅｋｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｈｏｒｍｏｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｍｅｄｉｕｍ，?ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｔｏ?ｓｏｌｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?（ｗｎｅｓ）?ｆｏｒ?１?ｗｅｅｋ，?ａｎｄ?ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ?ｃａｌｌｕｓ；?ｂ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｆｔｅｒ?７?ｗｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｆｔｅｒ?１０?ｗｅｅｋｓ??期間也嘗試過將在液體中培養(yǎng)５周的‘?Ｘ?Ｌ?Ｈ＇外植體轉(zhuǎn)移到不含激素的固中，結(jié)果如圖２．２ａ，仍是在不斷形成白色蓬松的愈傷組織。繼續(xù)培養(yǎng)圖２．２?ｃ形成的仍都黃色或黃白色海綿狀趦于褐化的非胚性愈傷組織。??改用激素組合ＮＡＡ?＋?６－ＢＡ結(jié)果如下表２．３，也是誘導(dǎo)出疏松的非胚性。而６－ＢＡ?＋?１ＡＡ的激素組合則使外植體葉片狀的不斷膨大，分化出少，會(huì)形成不定根。后續(xù)培養(yǎng)放在同一培養(yǎng)基上外植體繼續(xù)膨大，并傷組織出現(xiàn)。??培養(yǎng)基中不同配比濃度６－ＢＡ＋ＮＡＡ對培養(yǎng)＿３用甜瓜＞ＸＬＨ’愈傷組織誘導(dǎo)的影

?ＪＳ?ＨＤＺ??翁藝＿??圖２．２不同基因型甜瓜液體培養(yǎng)５周后憒況（激素組合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?５?ｗｅｅｋｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ?ｍｅｌｏｎ?（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ??２ｍｇ／Ｌ－ｌ－６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｓ３?圍?Ｂｉ??圖２．３甜瓜品種‘ＡＭ’液體培養(yǎng)５周（ａ）后和７周后（ｂ－ｃ）情況（激素組合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ??０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｍｅｌｏｎ?ｆｃＡＭ９?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｌｉｑｕｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?ａｆｔｅｒ?５?ｗｅｅｋｓ（ａ）?ａｎｄ?７?ｗｅｅｋｓ（ｂ－ｃ）??（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??２０??

２ｍｇ／Ｌ－ｌ－６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｓ３?圍?Ｂｉ??圖２．３甜瓜品種‘ＡＭ’液體培養(yǎng)５周（ａ）后和７周后（ｂ－ｃ）情況（激素組合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ??０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｍｅｌｏｎ?ｆｃＡＭ９?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｌｉｑｕｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?ａｆｔｅｒ?５?ｗｅｅｋｓ（ａ）?ａｎｄ?７?ｗｅｅｋｓ（ｂ－ｃ）??（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??２０??
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 時(shí)亞斌;;植物體細(xì)胞胚成熟的影響因素[J];林業(yè)勘查設(shè)計(jì);2016年01期

2 曾文丹;陸柳英;謝向譽(yù);嚴(yán)華兵;;木薯體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生研究[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年07期

3 李玲;桂明春;管艷;王亞;梁國平;田海;;激素對橡膠樹次生體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)的影響[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2015年31期

4 張娜;張艷艷;王翠華;張秀秀;唐佳;高慧茹;;探討棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分析[J];考試周刊;2017年34期

5 陶雷;楊揚(yáng);由香玲;;五加科植物體細(xì)胞胚發(fā)生研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2014年25期

6 李明;王樹香;馮大領(lǐng);;植物體細(xì)胞胚發(fā)生及發(fā)育研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2011年03期

7 關(guān)亞麗;潘琴;丁朝;;影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的幾個(gè)因素[J];海南廣播電視大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

8 吳安湘;金曉玲;熊芳;張日清;;觀賞植物體細(xì)胞胚發(fā)生的研究進(jìn)展[J];懷化學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué));2006年02期

9 詹忠根,張銘,徐程;植物非體細(xì)胞胚與人工種子[J];種子;2001年06期

10 黃上志;孫景欣;傅家瑞;;苜蓿體細(xì)胞胚發(fā)生與成苗研究 Ⅲ.脫落酸處理提高體細(xì)胞胚的質(zhì)量[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢;1992年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 顧玉紅;文冠果體細(xì)胞胚胎發(fā)生及形態(tài)建軍成機(jī)理的研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2005年

2 曾范昌;棉花體細(xì)胞胚發(fā)生與合子胚發(fā)育相關(guān)基因的鑒定、克隆與功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 陶雷;刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制的初步研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

4 葛曉霞;伏令夏橙胚性愈傷組織及其體細(xì)胞胚發(fā)生的表達(dá)譜分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 李哲馨;過表達(dá)LaMIR166a在落葉松ESMs成胚發(fā)育及其萌發(fā)過程中的功能研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2017年

6 劉玉博;細(xì)胞分裂素和生長素調(diào)控?cái)M南芥體細(xì)胞胚根端分生組織建立的分子基礎(chǔ)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 張靜;兩種中國原產(chǎn)百合體細(xì)胞胚發(fā)生及miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)初步解析[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 由翠榮;仙客來體細(xì)胞胚胎發(fā)生、發(fā)育及SERK基因在體細(xì)胞胚性轉(zhuǎn)化過程的表達(dá)特性[D];中國海洋大學(xué);2009年

9 施雪萍;樟樹體細(xì)胞胚再生體系的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化Barnase、PaFT基因的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 葛曉陽;棉花體細(xì)胞胚發(fā)育組學(xué)分析及JA和ABA調(diào)控的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 蘇南;基于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的甜瓜轉(zhuǎn)基因體系構(gòu)建[D];浙江大學(xué);2019年

2 于云飛;五味子體細(xì)胞胚再生植株生長特性及多倍體誘導(dǎo)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 嚴(yán)瑞;基于體細(xì)胞胚發(fā)生的五種切花百合高效再生體系建立[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 薛冰洋;兩種中國原產(chǎn)百合體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)初探[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 蓋美竹;基于體細(xì)胞胚發(fā)生的兩種中國原產(chǎn)百合多倍體創(chuàng)制[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

6 楊鳳美;葡萄風(fēng)信子體細(xì)胞胚發(fā)生與植株再生[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

7 牛遇達(dá);北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2007年

8 喬琦;防風(fēng)體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育的研究[D];陜西師范大學(xué);2005年

9 馮大領(lǐng);地錦和五葉地錦組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚發(fā)生的研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2004年

10 張恒濤;無籽西瓜體細(xì)胞胚發(fā)生及其細(xì)胞學(xué)觀察[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2857726