發(fā)布時間：2020-10-23 19:07

　　 栽培草莓(Fragaria xananassa)屬于多年生草本植物,因果實營養(yǎng)豐富,色澤鮮艷,深受消費者青睞。草莓果實屬于假果,鮮嫩多汁的果肉來自于花托,而覆蓋在花托表面的瘦果才是植物學(xué)意義上的果實。與其它薔薇科植物如蘋果和桃不同,草莓是非呼吸躍變型果實。栽培草莓是八倍體(2n=8 ×=56),來自4個不同的二倍體祖先種,因此其基因組非常復(fù)雜。二倍體森林草莓Fragaria vesca(F.vesca)是栽培草莓的祖先種之一,在北半球分布最廣。森林草莓基因組(～240Mb)相對較小、植株矮小、生命周期短、能夠進行高效的遺傳轉(zhuǎn)化,是研究栽培草莓和非呼吸躍變型果實的模式材料。本研究利用二代Illumina和三代SMRT測序技術(shù),系統(tǒng)挖掘了森林草莓中的可變剪切基因,分析了草莓花與果實發(fā)育過程中可變剪切的動態(tài)變化,并對兩個版本的森林草莓基因組進行了重注釋,顯著提升了森林草莓基因組注釋的準(zhǔn)確度和完整度。主要結(jié)果如下:1.在可變剪切分析中,三代比二代測序技術(shù)具有顯著的優(yōu)越性本研究采用PacBio公司的單分子實時測序技術(shù)(SMRT)及Illumina二代測序技術(shù)對森林草莓果實(花托)的可變剪切進行了系統(tǒng)挖掘和比較。通過SMRT鑒定到33,236個全長轉(zhuǎn)錄本,覆蓋草莓基因組v2.0.a1中的10,957個基因。我們發(fā)現(xiàn)雖然SMRT的測序深度比Illumina低,但SMRT可檢測到57.67%的多外顯子基因發(fā)生可變剪切,而Illumina只檢測到33.48%的多外顯子基因發(fā)生可變剪切,說明SMRT能更有效地鑒定可變剪切。2.森林草莓可變剪切圖譜的建立和果實發(fā)育過程中可變剪切的變化為了挖掘草莓果實發(fā)育過程中的可變剪切,收集先前的74個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),包括果實早期五個發(fā)育階段的不同部分,總數(shù)據(jù)量達(dá)到19億個讀段。通過分析發(fā)現(xiàn)共有66.43%的多外顯子基因發(fā)生可變剪切,其中內(nèi)含子保留(IR)占比最高,隨后分別為可變受體(AA)、可變供體(AD)和外顯子跳躍(ES)。此外,還發(fā)現(xiàn)有2,453個基因由于可變剪切導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域的獲得或缺失。通過挖掘果實發(fā)育過程中可變剪切的變化,發(fā)現(xiàn)草莓受精后的果實與受精前相比,內(nèi)含子保留(IR)顯著降低,而可變受體(AA)顯著增加。KEGG富集分析表明IR顯著降低的基因中剪切體途徑基因顯著富集,GO富集分析表明這些基因中一些重要的代謝基因顯著富集。此外,這些富集基因在果實發(fā)育第一階段的表達(dá)水平較高,從第二時期開始即大幅度降低,表明IR這種剪切方式可能是授粉受精后果實起始的重要調(diào)控機制。3.森林草莓V2基因組重注釋在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中,發(fā)現(xiàn)森林草莓基因組注釋準(zhǔn)確性差,而且只包含了蛋白編碼基因的編碼序列。為了提高森林草莓基因組的注釋質(zhì)量,優(yōu)化了基因組注釋流程,結(jié)合PacBio全長轉(zhuǎn)錄組和RNA-seq數(shù)據(jù),使用MAKER2,AUGUSTUS和PASA等軟件進行基因組注釋,同時利用Apollo進行人工校正。我們首先對森林草莓V2基因組進行重注釋,新注釋被命名為v2.0.a2。在新版注釋中,被調(diào)整或新增的基因有13,168個,7,370個基因具有可變剪切轉(zhuǎn)錄本,18,641個基因的5'和/或3'端具有UTR。BUSCO值由88.9%增加到95.7%。此外,增加了 1,938個lncRNA,171 個 miRNA 和 51,714 個小 RNA 簇。4.森林草莓V4基因組重注釋2018年,森林草莓V4基因組面世,因采用PacBio SMRT測序數(shù)據(jù)進行組裝,其組裝質(zhì)量大幅度提高,與V2相比增加了 24.96Mb序列,基因數(shù)目卻減少了數(shù)千個。另外,舊版森林草莓基因組均采用geneXXXXX命名基因,而V4基因組采用新的基因命名方式FvH4_XgXXXXX。為了改善新版基因組注釋質(zhì)量,建立了新注釋v4.0.a2。在新注釋中,基因數(shù)量由28,588個增加到34,007個,BUSCO評估完整度高達(dá)98.1%;調(diào)整了 8,342個現(xiàn)有基因的基因模型,添加了 9,029個新基因,10,176個基因能夠產(chǎn)生可變剪切本。利用前期發(fā)表的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),建立所有基因在46種不同組織中的表達(dá)譜,方便讀者查詢。此外,鑒定了 84個已知miRNA基因和63個草莓特有miRNA基因,并預(yù)測了它們的靶基因。綜上所述,我們的研究表明SMRT測序在識別可變剪切方面有非常大的優(yōu)勢,同時為后期對不同剪切本的功能研究提供了豐富的資源。此外,可變剪切不同類型的轉(zhuǎn)變可能有助于果實形成時基因表達(dá)的快速變化。新注釋在基因預(yù)測的準(zhǔn)確性和完整性方面得到了顯著改善,有利于草莓中的基因功能研究以及薔薇科其他園藝植物的比較基因組分析。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S668.4
【部分圖文】：

ｇ－?Ａ?ＡＡＡ?Ａ?Ａ?關(guān)■關(guān)??Ｖ?ＷＦｔａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?１？?Ｗｈａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?２？?Ｗｈａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?３？??圖１－１?Ｓａｎｇｅｒ測序與第二代測序的原理比較（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ?ａｎｄ?Ｊｉ?２００８）??Ｆｉｇ．１－１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?Ｓａｎｇｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?（Ｓｈｃｎｄｕｒｅ??ａｎｄ?Ｊｉ?２００８）??Ｓｏｌｕｌ測序技術(shù)由ＡＢＩ公司于２００７年推出的測序技術(shù)，它運用連接酶催化的反??應(yīng)對ＤＮＡ進行測序，替換了之前的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Ｓｏｈｄ測序以熒光標(biāo)記的寡核??苷酸的不間斷合成為基礎(chǔ)，對ＤＮＡ片段進行擴增和測序。這個測序平臺的單堿基??質(zhì)量最高且成本低，被廣泛應(yīng)用于ＳＮＰ的鑒定，但由于Ｓｏｌｕｉ產(chǎn)生的讀段在二代測??序中最短，因此不適用于轉(zhuǎn)錄組和基因組的組裝。??目前使用最多的是ｌｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ測序技術(shù)，因其性價比最高，所以應(yīng)用最??廣泛。Ｉｌｌｕｍｍａ平臺使用邊合成邊測序技術(shù)（ＳＢＳ）和３’端可逆的終止子技術(shù)應(yīng)用??于測序中，能夠?qū)崿F(xiàn)平行化和自動化測序。測序過程中，往每個泳道加入四種不同??的熒光標(biāo)記的核苷酸（Ａ、Ｔ、Ｃ和Ｇ）和ＤＮＡ聚合酶。在聚合酶的作用下

或影響ｍＲＮＡ的穩(wěn)定性或翻譯能力（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１３）。對于多外顯子的??ｍＲＮＡ，剪切模式包含多種方式，包括外顯子跳躍（ＥＳ）、內(nèi)含子保留（ＩＲ）、可變??受點（ＡＡ）和可變供點（ＡＤ）（圖１－３）?（Ｂｌａｃｋ?２００３）。大部分物種一半以上的基因都含??有多條剪切本，因此，基因的可變剪切極大地增加了整個轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜??性和靈活性。??，ｓｏｆｏｎｎ?１?ｉ＞〇ｒ〇ｎｎ?Ｉ?■■■■■■■?ｗｍｍｍａｍ??ＰｒｃｍＲＮＡ?ＭＢ?ＭＢ?ＭＢ?Ｗ?■■■■■?Ｈｉ?ＢＨｉ??ｌｓｏｆｏｒｍ２?ｌ％ｏｆｏｍ２??Ｅｘｏｎ?ｓｋｉｐｐｉｎｇ?（ＥＳ）?Ｉｎｔｒｏｎ?ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?（ＩＲ）??Ｉｗｆｏｒｍ?Ｉ??Ｐｒｃ－ｍＲＮＡ?ｐｒｔ－ｍＲＮＡ??Ｉｓｏｆｏｍｔ?２?ｌｓｏｆｏｒｍ?２??Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ａｃｃｅｐｔｏｒ?ｓｉｔｅｓ?（ＡＡ）?Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ｄｏｎｏｒ?ｓｉｔｅｓ?（ＡＤ）??圖１－３可變剪切的主要類型（Ｂｌａｃｋ?２００３）??Ｆｉｇ．?１－３?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ｓｐｌｉｃｉｎｇ?（Ｂｌａｃｋ?２００３）??８??

１４８個全長轉(zhuǎn)錄本和３６８，５７０個非全長轉(zhuǎn)錄本（表２－４）。轉(zhuǎn)錄本的長度密度圖顯??示三個明顯的峰與三個文庫的預(yù)期大小相一致，轉(zhuǎn)錄本的平均長度為２，４６６?ｂｐ，長??度顯著大于草莓注釋基因的平均長度（Ｕ８７?ｂｐ）（圖２－２ａ）。通過ＧＭＡＰ?（Ｗｕ?ａｎｄ??Ｗａｔａｎａｂｅ?２００５）將轉(zhuǎn)錄本比對到Ｆ．?基因組ｖ２．０．ａｌ，發(fā)現(xiàn)８９．２％的轉(zhuǎn)錄本能夠??比對到１３，２８４個已注釋基因（總基因數(shù)量為３３，６７３）。１３，２８４個基因中有２，２２９個基??因上只有一條轉(zhuǎn)錄本（圖２－２ｂ），剩余８３．２２％基因含有兩條以上的轉(zhuǎn)錄本。每個基??因的對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的中位數(shù)約為１０；其中轉(zhuǎn)錄本最多的基因有３，５６１條轉(zhuǎn)錄本。??為了驗證三代測序能否用于計算基因的表達(dá)量，我們用二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ??Ｈｉｓｅｑ２５００平臺對ＳＭＲＴ測序相同樣品進行鏈特異性測序，產(chǎn)生１６Ｇ高覆蓋度的讀??段。通過散點圖（ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）來評估ＳＭＲＴ測序與Ｉｌｌｕｍｉｎａ測序之間表達(dá)水平的??相關(guān)性，最終得到它們之間的相關(guān)性（ＲＡ２）只有０．１７?（圖２－２ｃ），說明ＳＭＲＴ測序??不適合計算基因的表達(dá)水平。不過
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