原生質(zhì)體技術是新興的細胞工程技術,在去除細胞壁的基礎上,可進行細胞雜交,有利于突破種、屬界限、縮短育種周期、可實現(xiàn)遠緣物種基因融合。本試驗從側耳屬真菌品種中,選取平菇、秀珍菇、鮑魚菇三個種類,研究了原生質(zhì)體制備和再生條件,包括穩(wěn)滲劑種類、菌齡、酶解溫度及時間、再生培養(yǎng)基種類。試驗設計采用單因素試驗,確定了平菇、秀珍菇、鮑魚菇原生質(zhì)體制備、再生的最佳條件并篩選了優(yōu)勢的單核菌株,為冀中南地區(qū)側耳屬菌株選育提供技術應用依據(jù)。⑴平菇品種選用性狀優(yōu)良的“680”為材料。研究結果表明,原生質(zhì)體制備產(chǎn)量最高的條件是以采用固體培養(yǎng)菌絲的方式,0.6mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,取0.03g菌絲,在濃度為2%的溶壁酶酶解液中30℃酶解2.5h,菌齡8d,獲得原生質(zhì)體量為2.6×10~7個/mL。優(yōu)化條件下得到的原生質(zhì)體再生時間7d,再生率達6%;⑵秀珍菇品種選用“中農(nóng)袖珍”為材料,研究結果表明,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的條件是采用固體培養(yǎng)菌絲方式,以0.6mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,取0.04g菌絲,濃度為2%的溶壁酶酶解液中35℃酶解2h,菌齡為8d,獲得原生質(zhì)體量為2.4×10~7個/mL。優(yōu)化條件下得到的原生質(zhì)體再生時間6d,再生率達0.7%;⑶以本實驗室保存的鮑魚菇菌絲為材料,研究結果表明,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的條件是液體靜置培養(yǎng)的菌絲體,以0.6mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,以0.04g菌絲量在濃度為2%的溶壁酶酶解液中30℃酶解2h,菌齡為10d,獲得原生質(zhì)體量為1.2×10~7個/m L。優(yōu)化條件下得到的原生質(zhì)體再生時間12d,再生率達0.3%;本試驗在側耳屬品種(平菇、秀珍菇、鮑魚菇)中,原生質(zhì)體制備與再生的基礎上篩選出優(yōu)勢單核菌株,以篩選出的平菇、鮑魚菇的單核菌株作為親本菌株,利用融合劑PEG進行融合,最終獲得兩株融合子R1、R2。通過顯微鏡觀察鎖狀聯(lián)合和拮抗試驗,從菌絲特征和生化水平上確定了融合子。通過酯酶同工酶證明融合子R1、R2具有雙親的特異條帶,ISSR分子標記表明融合子含有雙親的遺傳物質(zhì)。
【學位單位】：河北工程大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

生率=（再生培養(yǎng)基菌落數(shù)-PDA 培養(yǎng)基上長的菌落數(shù)）/接種數(shù) 平菇原生質(zhì)體制備結果與分析1 滲穩(wěn)劑種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響析天平稱 0.02g 菌絲放入以 0.6mol/L 甘露醇、蔗糖、氯化鉀配制的中，30℃酶解 3h，每隔 0.5h 把離心管從水浴鍋拿出到超凈工作臺球計數(shù)板上計算原生質(zhì)體數(shù)量，試驗結果如圖 2-1。從圖中可以看做穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體的產(chǎn)量一直很低，遠遠低于甘露醇和蔗糖。以蔗糖做滲穩(wěn)劑在 2h 產(chǎn)原生質(zhì)體量差距不大，分別為 15.8×l06個l06個/mL 甘露醇在 2h 達高峰后，隨后開始下降，蔗糖在 2.5h 達高質(zhì)體量為 20.3×l06個/mL。兩種穩(wěn)滲劑產(chǎn)量達到高峰后隨著酶解時又呈下降趨勢。

河北工程大學碩士學位論文.3.2 溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響0.02g 菌絲用分析天平稱好，放入配好的酶液中，分別在 25℃、30、40℃條件下酶解 3h，每個溫度下每隔 0.5h 取樣測原生質(zhì)體數(shù)量度在不同的酶解時間產(chǎn)原生質(zhì)體量如圖 2-2。從圖中可以看出，25時原生質(zhì)體的產(chǎn)量較低。30℃和 35℃在 2.5h 產(chǎn)原生質(zhì)體量同時達分別為 2.36×l07個/mL 2.33×l07個/mL，隨后開始下降，平菇制備時溫度在 30℃產(chǎn)量最高。

圖 2-3 菌絲量對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig. 2-3 The effect of biomass of mycelium on the number of protoplas4 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響3g 菌絲用分析天平稱好后放入配制好的酶解液中，30℃酶解，在不同時間取樣測定原生質(zhì)體產(chǎn)量，結果如圖 2-4 所示，在，原生質(zhì)體量迅速增加，折線圖斜率很大。在 2.5h 時達到產(chǎn)×107個/ml，隨后原生質(zhì)體產(chǎn)生量逐步下降，故制備鮑魚菇的解時間 2.5h 為宜。生質(zhì)體產(chǎn)量×原菌絲量/g
【參考文獻】

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