藍(lán)毒屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)多年生灌木或小灌木,其果實富含花青素等功能成分,被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一。藍(lán)莓根系不發(fā)達(dá),根系淺,無根毛,呈纖維狀,主要分布在淺層土壤中。因此,相對于其他果樹,土壤緊實度、有機(jī)質(zhì)含量等理化性質(zhì)以及菌根狀況對其生長發(fā)育的影響更為明顯,其中,菌根的存在尤為重要,但相關(guān)機(jī)理缺乏系統(tǒng)的調(diào)查和研究。本論文在分析藍(lán)莓根系發(fā)生過程的基礎(chǔ)上,通過基因克隆及表達(dá)模式研究揭示藍(lán)莓根毛缺失的分子機(jī)理;設(shè)置滅菌與未滅菌土壤處理藍(lán)莓組培苗,探究土壤微生物對藍(lán)莓生長的影響;同時,對當(dāng)?shù)厮{(lán)莓菌根真菌進(jìn)行分離、鑒定,并篩選出對藍(lán)莓生長有積極促進(jìn)作用的菌根真菌,以期得到有益菌株和適宜的接種方式,為藍(lán)莓菌根真菌的研究及藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。主要研究結(jié)果如下:以藍(lán)莓'布里吉塔' 2年生植株根系為試材,通過基因克隆和表達(dá)分析初步探究藍(lán)莓根毛缺失的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示,從藍(lán)莓根系cDNA中僅擴(kuò)增到根毛發(fā)生相關(guān)基因WER、TTG和GL2,卻未能擴(kuò)增到CPC、ETC1和TRY。結(jié)構(gòu)分析表明,WER、TTG和GL2所編碼蛋白與其它具有根毛植物一樣具有典型結(jié)構(gòu)域,且GL2,WER親緣關(guān)系跟葡萄關(guān)系最近,表明其蛋白功能具有相似性。由于CPC、ETC和TRY不表達(dá),而WER、TTG和GL2具有正常功能,可推測藍(lán)莓無根毛是因為WER和TTG/GL3-EGL3復(fù)合體結(jié)合正調(diào)控GL2的表達(dá),從而抑制了根毛的發(fā)生。以無菌藍(lán)莓'布里吉塔'組培生根苗為試材,利用土壤滅菌與未滅菌的處理,探究根際微生物對藍(lán)莓組培苗生長的影響。結(jié)果顯示,相較于滅菌土,未滅菌處理組的藍(lán)莓生長量普遍提高,且地上部的優(yōu)勢更為明顯;但其根際細(xì)菌與真菌的數(shù)目卻低于滅菌處理組,其中細(xì)菌的數(shù)目差異最為顯著,真菌數(shù)目雖然也低于滅菌組,但存在明顯的根系內(nèi)生真菌,即優(yōu)勢菌明顯;未滅菌處理的藍(lán)莓根際土壤的蔗糖酶和過氧化氫酶活性高于滅菌組0.56及2.15倍。以田間5年生北高叢'布里吉塔'藍(lán)莓、'杰兔'藍(lán)莓和南高叢'夏普藍(lán)'藍(lán)莓根系為試材,通過根段分離純化、ITS序列擴(kuò)增對三種藍(lán)莓的根系共生真菌進(jìn)行鑒定,并經(jīng)過篩選后對藍(lán)莓'布里吉塔'組培苗進(jìn)行回接實驗。結(jié)果顯示,分別從'布里吉塔'藍(lán)莓根系分離篩選得到9株真菌,'杰兔'藍(lán)莓根系分離篩選得到9株真菌,'夏普藍(lán)'藍(lán)莓根系分離篩選得到8株真菌,經(jīng)分子鑒定后發(fā)現(xiàn),同種藍(lán)莓根系分離得到的菌根真菌雖然形態(tài)特征上差異明顯,但I(xiàn)TS序列鑒定后卻是相近或相同的,如B1209(Talaromyces aculeatus)和 B1210(Talaromyces verruculosus)、T1205/T1213/T1214(Helotialessp.)和 T1206(Helotiales sp.)同屬不同種;T1205 和 T1213、T1214 同屬于Helotiales sp.(AB847035.1),X1206 和 X1209 同屬于Epacris microphylla root associated fungus(AY268189.1)。同時,不同種藍(lán)莓根系的菌根真菌也有相同,如B1207 和 T1209、X1206、X1209 都屬于Epacris microphylla root associated fungus(AY268189.1),B1205 和 X1205 都屬于Thozetellasp.(JX244056.1),X1207 和T1205、T1213、T1214都屬于Helotialessp.(AB847035.1)。將上述菌株回接至藍(lán)莓組培無菌苗中,2個月后測其生物量生長發(fā)現(xiàn),B1202(Trichoderma gamsii)和B1206(Uncultured Ascomycota)對組培苗的地上部促生作用顯著,能明顯改善藍(lán)莓的生物量。綜上,藍(lán)莓根毛缺失是由于CPC、ETC1和TRY的不表達(dá),而WER、TTG和GL2具有正常功能導(dǎo)致的,但相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究;土壤未滅菌處理的藍(lán)莓苗長勢優(yōu)于滅菌處理,說明根際微生物對藍(lán)莓生長起到了促進(jìn)作用;藍(lán)莓根系菌根真菌在不同品種間有相似,也有差異,回接實驗中,B1202和B1206的促生作用最為顯著。
【學(xué)位單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S663.9
【部分圖文】：

第二章藍(lán)莓根毛缺失相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析。同時，采用ＤＮＡＭＡＮ?（７．０）軟件對預(yù)擬南芥（Ａ從蛋白序列、水稻（Ｏ．Ｍ／ｉｖ葡萄（Ｋ?ｖ／７峨ｒａ）蛋白序列作對比，并利用ＭＥ中擴(kuò)增根毛發(fā)育相關(guān)基因ＣＰＣ、五；ＴＣ八７７＾、在電泳圖中都能清晰的觀察到亮帶，說明這６

到它們在擬南芥、水稻、玉米及葡萄中的同源蛋白，并用ＭＥＧＡ７．０軟件構(gòu)建ＮＪ進(jìn)??化樹。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓ＧＬ２具有１個典型的ＳＴＡＲＴ結(jié)構(gòu)域，其與葡萄親緣??關(guān)系較近，而與玉米、水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖２．３）；藍(lán)莓ＴＴＧ具有４個保守的??ＷＤ４０結(jié)構(gòu)域，與擬南芥親緣關(guān)系較近而與葡萄親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖２．４）；藍(lán)莓ＷＥＲ??存在２個ＳＡＮＴ結(jié)構(gòu)域，與葡萄親緣關(guān)系較近（圖２．５）。??■Ｂｉ１１?ＳＴＡＲＴ??０?ｔｏｏ?２ＱＳ?３００?４００??１ＣＤ???ＭＭ?ＶＢｒｉｇｉｔｔａ???竺＿??葡萄?ＫＷｍ＞＊ａ（ＧＳＶＴＶＴ０１０１７（ｍ（Ｋ）ｌ）?????掇南芥?Ａ／／ｗ／如ｍ？（ＡＴｌＧ７站４０，２＞???水稻?ａ？＾ｗ（ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ５５５４９．１）???玉米?Ｚ／ｍ＾ｓＣＧＲＭＺ＾ＶｎＧＯＯｌＳＳ＾Ｏ??圖２．３?ＧＬ２蛋白結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化樹??Ｆｉｇ．?２．３?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｏｍａｉｎ?ａｎｄ?ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＧＬ２??１６??

?ＴＯＯ??１００?ｂｐＢ??圖２．２?ｃＤＮＡ克隆電泳圖??Ｆｉｇ．?２．２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｃＤＮＡ?ｃｌｏｎｅ??３．３藍(lán)莓ＧＬ２、ＴＴＧ、ＷＥＲ結(jié)構(gòu)域分析及構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹??對在藍(lán)莓根系表達(dá)的ＧＬ２、ＴＴＲ和ＷＥＲ的ｃＤＮＡ全長進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)庫搜索得??到它們在擬南芥、水稻、玉米及葡萄中的同源蛋白，并用ＭＥＧＡ７．０軟件構(gòu)建ＮＪ進(jìn)??化樹。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓ＧＬ２具有１個典型的ＳＴＡＲＴ結(jié)構(gòu)域，其與葡萄親緣??關(guān)系較近，而與玉米、水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖２．３）；藍(lán)莓ＴＴＧ具有４個保守的??ＷＤ４０結(jié)構(gòu)域，與擬南芥親緣關(guān)系較近而與葡萄親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖２．４）；藍(lán)莓ＷＥＲ??存在２個ＳＡＮＴ結(jié)構(gòu)域，與葡萄親緣關(guān)系較近（圖２．５）。??■Ｂｉ１１?ＳＴＡＲＴ??０?ｔｏｏ?２ＱＳ?３００?４００??１ＣＤ???ＭＭ?ＶＢｒｉｇｉｔｔａ???竺＿??葡萄?ＫＷｍ＞＊ａ（ＧＳＶＴＶＴ０１０１７（ｍ（Ｋ）ｌ）?????掇南芥?Ａ／／ｗ／如ｍ？（ＡＴｌＧ７站４０，２
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2838783