芥子油苷是一種富含硫和氮的來源于氨基酸的次生代謝產(chǎn)物,存在于十字花科植物中。根據(jù)前體氨基酸的種類不同,可以將芥子油苷分為吲哚族芥子油苷、脂肪族芥子油苷和芳香族芥子油苷。芥子油苷的水解產(chǎn)物具有多樣的生物活性。西蘭花(又稱青花菜)作為一種非常受歡迎的蔬菜,其中巨大的營養(yǎng)價(jià)值與抗癌活性物質(zhì)受到越來越多的關(guān)注。西蘭花的抗癌活性主要來源于一種脂肪族芥子油苷的次生代謝產(chǎn)物蘿卜硫素,最新研究表明某些吲哚族芥子油苷的水解產(chǎn)物也具有抗癌活性,并且在植物抵御病原菌和蟲害過程中起到重要的作用。在模式植物擬南芥中,吲哚族芥子油苷的代謝途徑已經(jīng)被研究透徹。有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子類MYB家族成員在吲哚族芥子油苷的合成調(diào)控中起到重要的作用,分別為MYB51、MYB34和MYB122。MYB51主要在地上部分調(diào)控吲哚族芥子油苷的合成,MYB34主要負(fù)責(zé)根中的調(diào)控。超量表達(dá)MYB51可以增加吲哚族合成基因的表達(dá),從而增加吲哚族芥子油苷的含量。植物通過吲哚族芥子油苷防御病原菌的機(jī)理也逐漸被揭示,吲哚族芥子油苷與其降解產(chǎn)物可以觸發(fā)細(xì)胞壁胼胝質(zhì)的合成,減弱病原菌導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡。近年來,隨著其他十字花科植物的基因組測序,芥子油苷通路及其調(diào)控因子也逐漸被鑒定,一些蕓薹屬蔬菜中吲哚族芥子油苷合成基因的表達(dá)模式也陸續(xù)被報(bào)道。然而,在廣受歡迎的蔬菜西蘭花中,調(diào)控吲哚族芥子油苷關(guān)鍵基因MYB51的生理功能和分子特性還是未知。本研究克隆并鑒定了一個(gè)西蘭花基因MYB51,命名為BoMYB51。通過在擬南芥中超量表達(dá)BoMYB51,分析吲哚族芥子油苷代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)以及芥子油苷的含量,檢測Flg22(Flagellin22)誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積。通過在擬南芥中表達(dá)BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS(β-glucuronidase)及Real-time PCR技術(shù),分析了BoMYB51的組織表達(dá)特性與激素和脅迫下的表達(dá)模式,初步揭示BoMYB51的分子特性和可能參與的生理過程。通過本研究,將加深對蕓薹屬蔬菜吲哚族芥子油苷調(diào)控機(jī)理的理解,為十字花科吲哚族芥子油苷的研究提供理論數(shù)據(jù),為改良抗病西蘭花品種奠定理論基礎(chǔ)。本研究的主要研究結(jié)果如下:(1)BoMYB51的克隆與生物信息學(xué)分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得的MYB51參考序列,利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid-amplification of cDNA Ends,RACE)克隆西蘭花“青秀”品種的MYB51 mRNA全長。MYB51的cDNA全長1641 bp,其中5’端非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR)長度為355 bp,3’端非編碼區(qū)長度為323 bp,編碼區(qū)(Coding sequence,CDS)長度為963 bp,可編碼320個(gè)氨基酸,我們將其命名為BoMYB51(基因序列登錄號(hào):No.MF693155)。(2)BoMYB51超量表達(dá)及功能分析構(gòu)建BoMYB51超量表達(dá)載體并對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,得到5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。通過Real-time PCR方法分析吲哚族芥子油苷相關(guān)基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)核心結(jié)構(gòu)合成相關(guān)基因TSB1、CYP79B2、CYP83B1和SOT16上調(diào)表達(dá),結(jié)構(gòu)修飾基因CYP81F2和IGMT2表達(dá)水平則不變,而吲哚族芥子油苷降解基因TGG1和PEN2和吲哚族芥子油苷合成調(diào)控基因MYB34和MYB122的表達(dá)水平下降。通過高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)檢測野生型和超量表達(dá)擬南芥的芥子油苷含量,發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)BoMYB51的擬南芥中吲哚族芥子油苷的含量顯著升高,脂肪族芥子油苷除了蘿卜硫素(4-methyl sulphinylbutyl Glucosinolate,4MSOB)含量下降外沒有顯著變化。結(jié)果表明BoMYB51可以通過提高吲哚族芥子油苷合成基因的表達(dá)來提高吲哚族芥子油苷的含量。通過Flg22處理野生型和超量表達(dá)的擬南芥植株,檢測胼胝質(zhì)的沉積,發(fā)現(xiàn)在正常情況下,超量表達(dá)擬南芥的胼胝質(zhì)沉積比野生型強(qiáng)。而Flg22處理下,野生型和超量表達(dá)擬南芥的胼胝質(zhì)沉積都被誘導(dǎo),而超量表達(dá)擬南芥的誘導(dǎo)程度更強(qiáng)。結(jié)果表明超量表達(dá)BoMYB51可以增強(qiáng)Flg22誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積從而抵御病原菌侵害。(3)BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS組織定位表達(dá)模式分析構(gòu)建BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體并對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過GUS染色分析BoMYB51的組織定位表達(dá)情況。結(jié)果表明在幼苗的子葉、真葉和根中均有明顯的GUS信號(hào),成苗期的葉片、葉柄、莖、花序和未成熟的角果上部分也有明顯的GUS信號(hào)。表明BoMYB51啟動(dòng)子廣泛的表達(dá)在植物各組織中。不同激素和脅迫處理下,BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)也不相同。水楊酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)顯著促進(jìn)GUS表達(dá),脫落酸(Abscisic acid,ABA)和乙烯(Ethylene,ET)對GUS表達(dá)沒有明顯影響,而赤霉素(Gibberellin acid,GA)表現(xiàn)出了不同組織的GUS特異表達(dá)現(xiàn)象。機(jī)械損傷系統(tǒng)的誘導(dǎo)了GUS表達(dá),Flg22、鹽、和紫外線(Ultraviolet,UV)處理也增強(qiáng)的GUS表達(dá),說明BoMYB51啟動(dòng)子活性不僅響應(yīng)激素的誘導(dǎo),而且也響應(yīng)生物和非生物的脅迫。(4)BoMYB51在西蘭花中的表達(dá)模式分析通過Real-time PCR法分析BoMYB51在西蘭花中的表達(dá)模式,證實(shí)了BoMYB51在各組織均有表達(dá)且與擬南芥中BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS組織表達(dá)情況相同。在不同激素和脅迫處理下,BoMYB51表達(dá)受SA、JA、Flg22、鹽、機(jī)械損傷和UV的誘導(dǎo),GA處理時(shí)分開檢測子葉和真葉的表達(dá)發(fā)現(xiàn)子葉中BoMYB51表達(dá)被誘導(dǎo),真葉中BoMYB51表達(dá)被抑制,這些結(jié)果與BoMYB51啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS的表達(dá)情況一致。然而在ABA、ET和干旱脅迫下,BoMYB51的表達(dá)被誘導(dǎo),與GUS表達(dá)情況不一致。綜上,BoMYB51響應(yīng)多種激素信號(hào)途徑,并且可能在非生物脅迫中也起到一定的作用。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S635.3
【部分圖文】：

的防衛(wèi)機(jī)制[12, 13]。1.2 吲哚族芥子油苷研究進(jìn)展1.2.1 吲哚族芥子油苷合成途徑吲哚族芥子油苷的合成途徑有兩個(gè)階段：核心結(jié)構(gòu)的形成和氨基酸側(cè)鏈的次級修飾（圖1-1）。細(xì)胞色素 P450 單加氧酶（CYPs）在核心結(jié)構(gòu)形成的初始階段起重要作用。CYP79B2和 CYP79B3 催化色氨酸形成吲哚-3-乙醛肟（Indole-3-acetaldoxime, IAOx）[14, 15]，IAOx 在CYP83B1 的作用下代謝為氧化形式[16, 17]，可以與硫醇類物質(zhì)反應(yīng)形成硫化肟集團(tuán)，在 C-S裂 解 酶 （ SUR1 ） 與 葡 萄 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （ UGT74B1 ） 的 作 用 下 形 成 脫 硫 的 芥 子 油 苷（desulfo-glucosinolate）[18]，最后經(jīng)過磺基轉(zhuǎn)移酶（SOT16）的硫酸化作用形成吲哚-3-甲基芥子油苷（Indol-3-ylmethyl-glucosinolate, I3M）[19]。吲哚族芥子油苷的次級修飾主要包括羥基化和甲基化。吲哚-3-甲基芥子油苷（I3M）經(jīng)過 CYP81Fs 催 化 轉(zhuǎn) 化 為 中 間 產(chǎn) 物 1- 羥 基 - 吲 哚 -3- 甲 基 芥 子 油 苷（1-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 1HO-I3M）和 4-羥基-吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 4HO-I3M）[20]，這些中間產(chǎn)物在吲哚族芥子油苷甲基轉(zhuǎn)移酶 1 和 2（IGMT1, IGMT2）的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為 1-甲氧基-3-吲哚甲基（ 1-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 1MO-I3M ） 和 4- 甲 氧 基 -3- 吲 哚 甲 基（4-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 4MO-I3M）[13

圖 1-2 R2R3-MYBs 12 亞族的進(jìn)化關(guān)系[25]Figure 1-2 Relationship between subgroup 12 R2R3-MYBs[25]YB34，MYB51 和 MYB122 統(tǒng)稱為 HIG-MYBs（high indolic GSL），調(diào)控吲哚族芥子成。MYB28，MYB29 和 MYB76 統(tǒng)稱為 HAG-MYBs（high aliphatic GSL），調(diào)控脂油苷的合成。2005 年，Celenza 等發(fā)現(xiàn) MYB 類轉(zhuǎn)錄因子 MYB34 促進(jìn)吲哚族芥子油

圖 1-3 植物防衛(wèi)調(diào)控吲哚族芥子油苷的信號(hào)模式[78]ignalling model for indolic glucosinolate regulation in pl激比如蟲害或病菌侵害，細(xì)胞損壞，芥子油苷與其油苷的含量。擬南芥遭遇桃蚜（Myzus persicae）后究發(fā)現(xiàn)吲哚族芥子油苷含量不變[80]。擬南芥遭遇甜菜
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉娜;蔡叢希;孫勃;張志明;汪俏梅;;核盤菌侵染擬南芥的過程及其芥子油苷的變化[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2011年02期

2 田云霞;戴紹軍;陳思學(xué);閻秀峰;;機(jī)械損傷對擬南芥蓮座葉芥子油苷含量和組成的影響[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2009年04期

3 苑鑫;戴紹軍;陳思學(xué);閻秀峰;;NaCl脅迫對擬南芥蓮座葉中芥子油苷含量的影響[J];東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

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本文編號(hào)：2836645