發(fā)布時間：2020-10-11 05:12

　　 基因表達的特異性調(diào)控對植物一病原物互作和抵抗逆境脅迫是至關重要的。microRNAs(miRNAs)作為一類長度在18到25個核苷酸之間的非編碼小RNA分子,可以在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的過程中通過抑制靶基因的表達,參與植物體內(nèi)多種生理生化反應過程。因此,揭示miRNAs在植物應答生物和非生物脅迫中的調(diào)控作用及分子機制具有重要意義。在番茄(Solanum lycopersicum)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種miRNAs與生物和非生物脅迫是密切相關的,其中非保守的miR1916和保守的miR396均在多種脅迫條件下作出響應,但具體的分子機制尚不明確,特別是對番茄在與晚疫病菌(Phytophthora infestans)和灰霉菌(Botryts cinerea)互作中miR1916和miR396的研究很少,且茄科植物中的抗逆作用也未得到廣泛的關注。針對上述問題,本研究通過基因工程改造策略、次生代謝水平分析及基因功能鑒定等方法,系統(tǒng)闡釋了番茄miR1916和miR396在抗逆過程中的多效調(diào)控機制。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)通過熒光實時定量檢測發(fā)現(xiàn)了 miR1916在番茄與晚疫病菌和灰霉菌互作中表達量變化明顯,借助生物信息學方法預測到了 miR1916的靶基因STR-2、UGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG,且這6個靶基因的表達均受到晚疫病菌和灰霉菌的誘導,利用 PPM-RACE 和 5'-RACE 驗證了 miR1916 對STR-2、MYB12和T、YBS12 和CC-NBS-LRR的切割位點。借助過表達和沉默技術獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過觀察感病表型,發(fā)現(xiàn)了過表達或(沉默)miR1916降低或(提高)了番茄對晚疫病菌和灰霉菌侵染的耐受性�；诜肿铀胶痛渭壌x產(chǎn)物檢查分析確定了 miR1916調(diào)控多種靶基因的表達,證實其既可以抑制識別病原體基因CC-NBS-LRR與CC-NBS,又可以影響花青素和a-tomatine積累的相關基因 STR-2、UGT和MYB12。(2)對番茄與晚疫病菌和灰霉菌互作過程中miR396進行檢測,發(fā)現(xiàn)了 miR396的表達量變化較明顯。并通過生物信息學方法預測到miR396的靶基因GRF1、SAMT、GH和NBS-LRR,且檢測到了這些靶基因在二種病原菌侵染時表達量發(fā)生改變。番茄對病原菌耐受性實驗結(jié)果顯示,miR396的過表達減弱了番茄對晚疫病菌和灰霉病菌的抗性,且提高了病原菌侵染時ROS的水平。對靶基因的表達量分析結(jié)果表明,miR396抑制了GRF1、SAMT、GAMT、GH和的表達,最終導致抑制下游抗病相關基因TGA1、TGA2和PR1及JA依賴的PII和II基因的表達,但卻增強了內(nèi)源SA含量和NPR1表達。miR396通過SA或JA信號途徑負調(diào)控靶基因及其下游基因表達是影響番茄響應生物脅迫的關鍵。(3)利用miR1916過表達和沉默載體,獲得了轉(zhuǎn)基因煙草。干旱脅迫實驗分析結(jié)果表明了 miR1916在煙草抗旱過程中是負調(diào)控因子,異源過表達和沉默miR1916影響了煙草靶基因HDAC和STR的表達量,及在干旱處理后的脯氨酸、可溶性糖和ROS的積累。(4)利用異源過表達miR396獲得了轉(zhuǎn)基因煙草,并進行了鹽、干旱和冷脅迫的耐受性分析,證實了過表達miR396會抑制GRF1、GRF3、GRF7和GRF8,進而引發(fā)了滲透調(diào)節(jié)能力的增強和ROS積累的減少,從而提高了煙草的抗逆性。因此,作為正調(diào)控因子參與多種脅迫的miR396具有全局調(diào)控的特性。綜上所述,本課題一方面發(fā)現(xiàn)感染晚疫病菌和灰霉菌的番茄與未感染番茄相比顯示出miR1916和miR396表達量的降低。miR1916的過表達和沉默可以影響靶基因STR-2、CGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG基因的表達,進而影響番茄對病原菌感染的抵抗。miR396通過抑制SA和JA信號的防御相關基因,作為負調(diào)控因子參與番茄防御病原菌。另一方面,通過異源轉(zhuǎn)基因改變miR1916和miR396的表達可以調(diào)控相應的靶基因表達水平揭示miR1916以負向調(diào)控的方式參與煙草抗旱,而miR396以正向調(diào)控的方式參與煙草耐鹽、抗旱和耐低溫的過程。
【學位單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

溫度、激素、厭氧、干旱和生物脅迫響應有關［１５４］。雖然這些順式作用元件的功能目前??并未驗證，但可以推測ｍｉＲ３９６在逆境脅迫中的響應機制和啟動子元件密不可分。ｍｉＲ３９６??在生長發(fā)育及逆境脅迫響應中的作用機制如圖１．２所示。??ｎ?〇?「⑨？??：：?城脈迫?＊??Ｉ?Ｖ?｜?Ｊ?一￣卜?＼ｍｉｉ７－Ｕｋｅ）?甘露酵脈迫?＞，勢??ｐｒｉ－ｍｉＲ３９６ａ?’??－＾?？高沒齡迫?：：??ｐｒｅ－ｍｉＲ３９６ａ?Ｍ￣？?抵抗線蟲生物蒭逡嘀應??Ｚ＆ｌＪ?ｊ?葉細胞增瘦?＇??／?＾?￥?ｍｉＲ３９６ａ－５ｐ?ａｎｄ?－３ｐ?／／?＿一＾?▲??［５＊?－?，?Ｉ?＼?／?葉細胞分化??挫雜＞）花發(fā)育??光響應無件ｔ?Ｐ?生??退度咕應元件□?＼＼圓一丨?堇成．吁過程ｉｆ??激素響應元件［Ｊ］?＼?１?’Ｉ?ＩＪ??厭細細ｆ?ｆ?根部生長??Ｚ１７Ｉ１?－黨－４－｜??應元件’?＿＿〇?—？?〇?神經(jīng)酰膚代謝）??圖１．２?ｍｉＲ３９６在生長發(fā)育及逆境脅迫響應中的作用機制??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｍｉＲ３９６?ｉｎ?ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ａｎｄ?ｓｔｒｅｓｓｅｓ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ??１．６本課題主要研究思路??番茄中ｍｉＲＮＡｓ在與病原物互作及非生物脅迫中起著關鍵作用。本實驗室前期工作??發(fā)現(xiàn)，在晚疫病菌的侵染后，番茄中多種ｍｉＲＮＡｓ發(fā)生表達的改變，其中ｍｉＲ１９１６和??ｍｉＲ３９６的變化明顯。二者在其他病原菌處理后和非生物脅迫條件下均能作出響應

２．３．７?Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６沉默載體的構(gòu)建??（１）?Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６的序列設計??數(shù)據(jù)庫ｍｉＲＢａｓｅ中呈現(xiàn)出的番爺ｍｉＲ１９１６與互補鏈二聚體結(jié)構(gòu)的序列如圖２．１Ａ所??示，根據(jù)人工合成ｍｉＲＮＡｓ的沉默技術原理，設計沉默序列的結(jié)構(gòu)。如圖２．１Ｂ所示，??Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６序列與ｍｉＲ１９１６序列完全互補，Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６＾列則改變原本ｍｉＲ１９１６??與ｍｉＲ１９１６４的錯配位點，在第５和９位堿基處設計２個錯配位點，其中去除Ｇ：Ｕ錯配。??Ａ??Ａ?Ｃ??５’?ＡＵＵＵＣＡＣＵＵＡＧ，?ＣＡＣ?ＵＣＡＡ?３’?ｍｉＲ１９１６??ＩＩ?Ｉ?Ｉ?Ｉ�。�?ＩＩ?Ｉ?！?Ｉｌｌ?Ｉ?ＩＩ?ｌ??３

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【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 肖裕;欒雨時;;miR482介導的植物生物脅迫響應[J];植物生理學報;2014年06期

2 翟俊淼;欒雨時;崔娟娟;;miR396基因家族的進化及功能分析[J];植物研究;2013年04期

3 楊鳳璽;余迪求;;高表達擬南芥miR396提高煙草抗旱性(英文)[J];云南植物研究;2009年05期

4 劉冬梅;楊鳳璽;余迪求;;高表達miR396小分子導致擬南芥花柱頭彎曲[J];云南植物研究;2009年04期

5 ;Duplication and expression analysis of multicopy miRNA gene family members in Arabidopsis and rice[J];Cell Research;2006年05期

相關博士學位論文 前2條

1 楊柳;茄子黃萎病防衛(wèi)相關microRNA的鑒定及miR482、StoL13a的功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2013年

2 王晨;葡萄microRNA及其靶基因的識別、鑒定及作用方式研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

本文編號：2836119