桃屬于薔薇科李屬,是我國重要經(jīng)濟(jì)作物之一。由于傳統(tǒng)雜交育種已無法滿足我國桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,因此開發(fā)出更為高效的育種手段勢在必行。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的遺傳改良手段在果樹育種中得到了越來越多的運(yùn)用。然而,由于桃缺少高效穩(wěn)定的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系,使得利用基因工程方式進(jìn)行桃種質(zhì)改良困難重重�；诖�,本研究以‘秋蜜紅’、‘黃水蜜’和‘大久�！N不同基因型桃的花藥和花瓣為試驗(yàn)材料建立無菌體系,篩選出最佳誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基,以期建立三種基因型桃的高效再生體系;此外,由于李與桃同屬于李屬植物,且李遺傳轉(zhuǎn)化體系較為成熟,本研究以‘脆紅李’和‘黑寶石’李的下胚軸切片和子葉為外植體,探討了不同菌株、不同菌液濃度對GUS瞬時表達(dá)率和GUS染色效果的影響,以期建立李遺傳轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)進(jìn)行桃功能基因驗(yàn)證和通過遺傳轉(zhuǎn)化方法創(chuàng)新種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.桃花藥培養(yǎng)及愈傷組織的誘導(dǎo)(1)花藥愈傷誘導(dǎo)的最佳時期為小花蕾期,花藥的單核期,此時的花藥顏色為黃紅色。(2)花器官最佳的消毒方式為:75%酒精+0.1%NaClO消毒5 min。(3)適合花藥愈傷組織誘導(dǎo)的處理1培養(yǎng)基為:NN69培養(yǎng)基+Suc 60 g·L~(-1)+植物凝膠3.0 g·L~(-1)+6-BA2.0 mg·L~(-1)+2,4-D 1.0 mg·L~(-1)。適合花瓣愈傷組織誘導(dǎo)的處理2培養(yǎng)基為:NN69培養(yǎng)基+Suc 60 g·L~(-1)+植物凝膠3.0 g·L~(-1)+6-BA 1.0 mg·L~(-1)+2,4-D 0.5 mg·L~(-1)。對不同品種間愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行對比,結(jié)果表明:‘秋蜜紅’的愈傷組織形成率比較高,其花藥在處理1的條件下愈傷組織形成率高達(dá)22.08%,花瓣的愈傷組織形成率在處理2的條件下則高達(dá)100%。(4)根據(jù)形態(tài)學(xué)和組織學(xué)鑒定3種愈傷組織狀態(tài),黃色緊實(shí)狀和綠色緊實(shí)狀的為胚性愈傷組織,淺黃色松散狀為嵌合體。2.李遺傳轉(zhuǎn)化體系初探(1)‘脆紅’李的遺傳轉(zhuǎn)化‘脆紅’李下胚軸切片為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時,當(dāng)菌株為EHA105,菌液濃度(OD_(600))為0.5時,‘脆紅’李下胚軸的GUS瞬時表達(dá)率為73.33%;‘脆紅李’子葉的GUS瞬時表達(dá)率高達(dá)100%,其中,片狀、深藍(lán)色的狀態(tài)為62.5%。(2)不同培養(yǎng)基對‘脆紅’李下胚軸切片褐化的影響比較了添加PVP與提高TDZ和IBA的濃度及配比,對‘脆紅’李下胚軸切片在遺傳轉(zhuǎn)化過程中抗褐化的效果,結(jié)果表明適合下胚軸分化的培養(yǎng)基為:3/4MS培養(yǎng)基+IBA 0.05 mg·L~(-1)+TDZ 3.0mg·L~(-1)+Tim 300 mg·L~(-1)+Kan 80 mg·L~(-1)+PVP 1.0 g·L~(-1)。(3)‘黑寶石’李下胚軸切片的遺傳轉(zhuǎn)化‘黑寶石’李下胚軸切片為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時,當(dāng)菌株為GV3101,菌液濃度(OD_(600))為0.5時,‘黑寶石’李下胚軸切片的GUS瞬時表達(dá)率為60%;‘黑寶石’李子葉的GUS瞬時表達(dá)率高達(dá)100%,其中,片狀、深藍(lán)色的狀態(tài)為79.24%。
【學(xué)位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S662.1
【部分圖文】：

圖 2-1 單核期的花蕾外部形態(tài)及細(xì)胞學(xué)觀察he external morphology and cytological observation of buds 蕾的開放狀態(tài)，圖標(biāo)比例尺 1 cm；B：花粉的發(fā)育時期在uds at the time of sampling, bar = 1 cm; B: The period of polperiod, bar = 5 um處理對外植體的影響

圖 2-3 花瓣在不同培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Fig,2-3. Growth of petals on different mediumA：花瓣接種時的狀態(tài)；B：NN69 培養(yǎng)基上長出的黃色緊實(shí)愈傷組織；C：MS 培養(yǎng)基上生長的黃白色，水漬愈傷A:The state of petal inoculation;B: Yellow compact callus grown on NN69 medium; C: Yellow and water-stained callus

圖 2-2 花藥愈傷組織各階段的生長狀態(tài)Fig, 2-2. Growth of anther callus at various stages藥接種時的狀態(tài)；B：花藥接種 15 d 時，花藥隔開裂，長出愈傷，圖標(biāo)比例尺 200 um；C：花藥接種 8 w 花藥長出顆粒狀愈傷；D：花藥愈傷褐化狀態(tài)；F：花藥愈傷水漬狀態(tài)，圖標(biāo)比例尺 1 mm
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2835717