白靈側(cè)耳(Pleurotus tuoliensis)是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要食用菌,市場(chǎng)潛力巨大。但白靈側(cè)耳栽培技術(shù)還不完善,尤其是白靈側(cè)耳菌絲生理成熟期的相關(guān)基礎(chǔ)研究缺乏。本文針對(duì)白靈側(cè)耳菌絲生理成熟期長(zhǎng)和管理存在的問(wèn)題,對(duì)其菌絲成熟度及過(guò)程控制進(jìn)行系統(tǒng)研究。在此基礎(chǔ)上,開(kāi)展不同后熟溫度和不同光照對(duì)三種胞外酶酶活和麥角固醇含量的影響進(jìn)行分析,并運(yùn)用代謝組學(xué)方法從整體上發(fā)現(xiàn)不同處理之間的代謝物差異,篩選相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步分析差異代謝物的變化趨勢(shì),探究白靈側(cè)耳菌絲生理成熟期生理生化變化規(guī)律,建立菌絲成熟度評(píng)價(jià)方法,為完善白靈側(cè)耳栽培技術(shù)理論建立提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過(guò)對(duì)菌絲生理成熟期的溫度、光質(zhì)的調(diào)節(jié),然后對(duì)相應(yīng)處理?xiàng)l件下白靈側(cè)耳菇蕾數(shù)量、子實(shí)體形狀、子實(shí)體平均產(chǎn)量等結(jié)果進(jìn)行分析,篩選出菌絲生理成熟期管理的最佳條件。同時(shí)對(duì)不同處理下菌絲體內(nèi)的麥角固醇含量和三種胞外酶酶活進(jìn)行了測(cè)定,通過(guò)不同處理之間的酶活變化曲線,尋找酶活性的變化規(guī)律,確定白靈側(cè)耳菌絲成熟度酶的參考指標(biāo)。通過(guò)不同處理之間的麥角固醇變化曲線,根據(jù)麥角固醇的變化趨勢(shì),推測(cè)在菌絲生理成熟期的最佳長(zhǎng)度。具體研究?jī)?nèi)容如下1、白靈側(cè)耳的菌絲生理成熟期在5種不同溫度控制下(17℃、20℃、23℃、26℃、29℃)培養(yǎng)35 d后進(jìn)入出菇管理,研究結(jié)果表明溫度為17℃時(shí),白靈側(cè)耳子實(shí)體質(zhì)量、大小穩(wěn)定,且出菇時(shí)間很集中,單個(gè)子實(shí)體的平均質(zhì)量為201.91 g/瓶,生物學(xué)效率為70.35%,且與其它處理差異顯著。在4種光照條件下(白光、紅光、藍(lán)光、黃光),藍(lán)光產(chǎn)量最高,單個(gè)子實(shí)體的平均質(zhì)量為182.91 g/瓶,生物學(xué)效率為63.73%,但與其它處理差異不顯著。因此,可以初步確定白靈側(cè)耳菌絲生理成熟期的最佳溫度為17℃。2、對(duì)白靈菇側(cè)耳菌絲生理成熟期5個(gè)溫度下胞外酶羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶的酶活的活性變化規(guī)律進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)羧甲基纖維素酶在第15 d達(dá)到最高值,而且不同處理間差異顯著,其中菌絲生理成熟期23℃處理(處理A3)的酶活最高,為4.02 U;但第35 d時(shí),該酶活性降低于菌絲后熟前期,且不同溫度下差異不顯著。淀粉酶活性在第5d左右達(dá)到最大值,其中A3處理的酶活最高,為5.83 U。半纖維素酶在菌絲成熟期活性變化很小,且溫度和光照對(duì)其活性影響也不大。3、使用HPLC法對(duì)菌絲生理成熟期麥角固醇含量進(jìn)行了的測(cè)定,結(jié)果表明在17℃、20℃、23℃和26℃處理時(shí),白靈側(cè)耳菌絲體的麥角固醇含量相對(duì)較高。溫度為29℃時(shí),麥角固醇含量相對(duì)較低,和其他實(shí)驗(yàn)處理差異顯著;且在光色為白光、藍(lán)光、黃光、紅光的光照處理組(處理B1、處理B2、處理B3、處理B4)中,菌絲體麥角固醇含量前期無(wú)較大變化,在菌絲生理成熟期第30 d后逐漸下降,其中B2(藍(lán)光)和B3(黃光)處理的含量最低。但在無(wú)光照條件下(處理B5),呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì),即在菌絲生理成熟期前期無(wú)較大變化,但在菌絲生理成熟期第30d后逐漸上升。在菌絲生理成熟期A1(17℃)、A2(20℃)、A3(23℃)、A4(26℃)和A5(29℃)的無(wú)光照條件下第35d麥角固醇含量達(dá)到最大,為5.13 mg/mL;在菌絲生理成熟期B1(白光)、B2(藍(lán)光)、B3(黃光)和B4(紅光)的有光照條件下則第30d麥角固醇含量達(dá)到最大,為5.73mg/mL。即有光照條件下,麥角固醇的含量會(huì)提前達(dá)到峰值,后熟周期可能可以減至30 d。4、運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別分析后熟0 d樣品(處理C1)8個(gè),后熟35 d、17℃(處理C2)樣品8個(gè),后熟35 d、29℃(處理C3)樣品8個(gè),進(jìn)一步運(yùn)用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principle component analysis,PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別,分析不同處理之間的代謝產(chǎn)物的差異。結(jié)果表明,PCA分析結(jié)果顯示不同處理之間和分析質(zhì)控樣本有分離趨勢(shì);OPLS-DA模型能將處理C1、處理C2和處理C3三組樣本分離。篩選組間差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)是OPLS-DA模型第一主成分的VIP值1,t檢驗(yàn)(Student’s t-test)返回的p值0.05。并計(jì)算出差異代謝物變化倍數(shù)FC(Fold change),共篩選出117種差異代謝物,其中有機(jī)酸、氨基酸和醇類物質(zhì)的共占了總代謝物的64%,還有一些胺類、酚類、糖類和酮類物質(zhì)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

圖 1.1 一般的代謝組學(xué)流程圖Figure 1.1 The typical workflow for metabolomics1.6.1 樣品分析技術(shù)代謝組學(xué)研究分析現(xiàn)有技術(shù)有其自身的特點(diǎn)和適用范圍，可以根據(jù)自身的需要和特點(diǎn)，選擇合適的研究方法和平臺(tái)，并基于此選擇優(yōu)化分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雖然大量的分析技術(shù)被用于代謝組學(xué)研究，但是這個(gè)階段使用的兩種技術(shù)是核磁共振（NMR）技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。核磁共振波譜技術(shù)（Nuclear magnetic resonance,NMR），NMR 的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度穩(wěn)定，對(duì)大多數(shù)的小分子代謝物都有相同的靈敏度，且 NMR 的樣品無(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理（Lindon，2008）。NMR 相對(duì)于 MS 的最大缺陷是檢測(cè)小分子代謝產(chǎn)的靈敏度不高，難以檢測(cè)到低豐度代謝產(chǎn)物，而且 NMR 可鑒定的代謝物數(shù)量還比較少。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）的樣品預(yù)處理比較簡(jiǎn)單而且可分析物的范圍大。不過(guò) LC-MS也有一些缺點(diǎn)，例如缺乏成熟完備的鑒定未知物的數(shù)據(jù)庫(kù)，而對(duì)于多級(jí)質(zhì)譜譜圖解析需要專業(yè)的解析知識(shí)。圖 1.2 為典型的 LC-MS 結(jié)構(gòu)示意圖。

圖 1.2 典型 LC-MS 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1.2 LC-MS system structure diagram氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatography coupled to mass spectrometry, GC/MS）的精準(zhǔn)度、靈敏度以及耐用型都非常突出，所以一般用于檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)（Almstetter，2009）。GC/MS 有完善成熟的商業(yè)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST/EPA/NIH），且 GC/MS 更多用于微生物和植物上（T'Kindt，2009）（Allwood，2009）（Koek，2006）（Garcia，2008）。在樣品的預(yù)處理上，為了增加樣品的揮發(fā)性，所以使用 GC/MS 平臺(tái)時(shí)需要將多樣品衍生化，因此 GC-MS 的樣品預(yù)處理比較繁瑣。NMR 的檢測(cè)靈敏度一致性和樣品預(yù)處理比較簡(jiǎn)單，但是靈敏度較低限制了其在生物標(biāo)志物篩選研究中的應(yīng)用。LC-MS 在靈敏度、重現(xiàn)性和可分析物范圍大。GC/MS 的優(yōu)點(diǎn)為在分辨率、靈敏度及具有商品化的 GC/MS 數(shù)據(jù)庫(kù)，但是 GC/MS 的樣品制備方法和適用范圍限制了其在非靶標(biāo)代謝物輪廓分析中的應(yīng)用。不過(guò)隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的逐漸成熟也使可分析物范圍越來(lái)越大，因此 GC-MS 逐漸成為代謝組學(xué)最常用的分析手段。雖然近年來(lái)，分析技術(shù)在一定程度上滿足了復(fù)雜樣品的分析要求，但是沒(méi)有任何一種或兩種方法完全滿足代謝組學(xué)對(duì)全譜分析的要求，發(fā)展更高效的分離技術(shù)和有效利用各種分離技術(shù)仍然是其未來(lái)的發(fā)展方向。

業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 結(jié)果與0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.005001000150020002500300035004000Y=3903.94956*X-24.0655R2=0.9999峰面積peakarea(A)濃度concentration(mg/mL)圖 3.4 HPLC 麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3.4 HPLC Standard curve of ergosterol

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2832052