桂花(Osmanthus fragrans)又名木犀、巖桂、丹桂、九里香,系木犀科木犀屬植物,原產(chǎn)我國,栽培歷史長達(dá)兩千多年,是著名的觀賞花木、園林樹種和芳香植物。桂花主要分為四個(gè)品種群,分別是四季桂品種群、金桂品種群、銀桂品種群和丹桂品種群。前期的研究已經(jīng)證明,桂花花瓣的顏色是由類胡蘿卜素積累的多少造成的,花瓣中類胡蘿卜素含量越高,花瓣的顏色就越深。桂花中的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase 4,CCD4)可以裂解類胡蘿卜素產(chǎn)生芳香物質(zhì)β-紫羅蘭酮。我們前期的研究證明β-紫羅蘭酮是桂花花瓣中含量最高的精油成分之一。因此,OfCCD4基因是決定桂花花香和花色的一個(gè)關(guān)鍵基因。本課題通過分子生物學(xué)方法研究桂花花色或花香產(chǎn)生的機(jī)理,驗(yàn)證OfWRKY3轉(zhuǎn)錄因子對OfCCD4基因表達(dá)的調(diào)控。該研究可以豐富桂花基礎(chǔ)理論知識(shí),為桂花花香成分的利用、桂花的花色改良以及新品種的培育提供理論依據(jù)。主要的研究內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)OfWRKY3與OfCCD4在桂花花瓣中的表達(dá)模式分析以丹桂和銀桂不同花期的花瓣為材料,通過RT-PCR的方法檢測了2個(gè)品種不同時(shí)期花瓣中WRKY3與CCD4基因的表達(dá)量,結(jié)果表明:WRKY3與CCD4基因的表達(dá)模式基本一致。同時(shí)利用激素JA,SA和ABA分別對桂花花瓣處理0h,1h,3h,6h和9h。利用熒光定量PCR分別檢測不同處理的桂花花瓣中WRKY3和CCD4基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示:WRKY3和CCD4基因表達(dá)都受激素JA,SA和ABA的誘導(dǎo),這兩個(gè)基因受激素誘導(dǎo)后的表達(dá)模式基本一致。上述結(jié)果表明,WRKY3可能參與了CCD4基因表達(dá)的調(diào)控。(2)OfWRKY3在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位分析。構(gòu)建OfWRKY3綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體(35S-OfWRKY3-GFP),并以35S-GFP作為對照,利用PEG4000介導(dǎo)通過微壓注射的方式轉(zhuǎn)入煙草葉片原生質(zhì)體中,暗環(huán)境下孵育12h,在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示:在對照組中,其GFP熒光幾乎全部定位在細(xì)胞質(zhì)中,而35S-OfWRKY3-GFP重組蛋白定位在細(xì)胞核中。說明WRKY3轉(zhuǎn)錄因子可能在細(xì)胞核中起作用參與調(diào)控了相關(guān)基因的表達(dá)。(3)構(gòu)建含35S-OfWRKY3基因超表達(dá)載體和OfCCD4-GUS重組靶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化煙草檢測GUS蛋白的活性。分別構(gòu)建35S-OfWRKY3超表達(dá)載體和OfCCD4-GUS重組靶質(zhì)粒通過微壓注射的方式共轉(zhuǎn)化煙草葉片,并以35S-GFP和OfCCD4-GUS重組靶質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化作為對照試驗(yàn)。孵育36h,通過對煙草葉片進(jìn)行組織化學(xué)染色定性研究GUS的表達(dá)水平,染色結(jié)果表明:在對照葉片中基本上未見有藍(lán)色,而OfWRKY3超表達(dá)的葉片中,沿葉脈處明顯被染成藍(lán)色,說明OfWRKY3基因的超表達(dá)促進(jìn)了GUS基因的表達(dá),OfWRKY3蛋白可以結(jié)合在OfCCD4啟動(dòng)子上促進(jìn)GUS基因的表達(dá)。(4)OfWRKY3蛋白在桂花花瓣中的瞬時(shí)超表達(dá)分別構(gòu)建35S:OfWRKY3超表達(dá)載體通過真空抽濾的方式共轉(zhuǎn)入丹桂盛花期花瓣中,并以35S-GFP作為對照。黑暗環(huán)境中孵育36h,提取花瓣中的總RNA,通過熒光定量PCR檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果證明,OfWRKY3轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)促進(jìn)了OfCCD4基因的表達(dá)。(5)OfWRKY3蛋白的體外表達(dá)及純化。將OfWRKY3轉(zhuǎn)錄因子基因序列,通過PCR擴(kuò)增得到目的片段,連接入pET-30蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,通過IPTG誘導(dǎo)OfWRKY3蛋白的表達(dá)。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測目的蛋白,并利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化,獲得了純化的OfWRKY3蛋白。(6)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證OfWRKY3轉(zhuǎn)錄因子是否能與OfCCD4基因上游的W-box序列結(jié)合。人工合成OfCCD4基因啟動(dòng)子的W-box元件序列,利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證W-box元件序列是否能夠與OfWRKY3蛋白相互結(jié)合,結(jié)果顯示:在同時(shí)加入OfWRKY3蛋白和W-box元件的泳道有明顯的滯留條帶,而同時(shí)加入蛋白、元件和競爭性探針的泳道無滯留條帶出現(xiàn),說明OfWRKY3蛋白在體外能夠和OfCCD4基因啟動(dòng)子上的W-box元件相互結(jié)合。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：Q943.2;S685.13
【部分圖文】：

2.3.2 熒光定量 PCR 分析經(jīng)激素處理后 OfWRKY3 與 OfCCD4 的表為了檢測 OfWRKY3 表達(dá)量的改變是否會(huì)引起 OfCCD4 基因表達(dá)量的變化，我三個(gè)花期中的銀桂和丹桂用植物激素水楊酸、茉莉酸、脫落酸處理后在 0 小、3 小時(shí)、6 小時(shí)和 9 小時(shí)時(shí)采摘花瓣進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(圖 2-2)。結(jié)果茉莉酸和脫落酸處理的花瓣，OfWRKY3 的轉(zhuǎn)錄水平在 3 小時(shí)的時(shí)候達(dá)到最高相比分別增加了 4.3 和 3.5 倍，之后慢慢恢復(fù)到最初的水平。而經(jīng)過水楊酸處其 OfWRKY3 的表達(dá)量在 6 小時(shí)時(shí)達(dá)到了最高，是起初的 2.3 倍，之后慢慢回小時(shí)時(shí)恢復(fù)到最初的水平。同時(shí)，在這三種激素處理的花瓣中 OfCCD4 基因(圖 2-2)與 OfWRKY3 基本一致。

花瓣其 OfWRKY3 的表達(dá)量在 6 小時(shí)時(shí)達(dá)到了最高，是起初的 2.3 倍，之后慢慢回落，在 9 小時(shí)時(shí)恢復(fù)到最初的水平。同時(shí)，在這三種激素處理的花瓣中 OfCCD4 基因的表達(dá)模式(圖 2-2)與 OfWRKY3 基本一致。圖 2-1. RT-PCR 對不同基因在丹桂和銀桂中不同時(shí)期的表達(dá)量檢測Fig 2-1. The expression profiles of different genes in different flowering stages were examined

常溫避光靜置 2 個(gè)小時(shí)。菌液，用微壓注射的方式轉(zhuǎn)入煙草煙草苗上取下，分離表皮細(xì)胞，經(jīng)Y3-GFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建OfWRKY3的引物序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)后回收，將提取的 S1300 質(zhì)粒與目組質(zhì)粒。將得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行菌證得到的片段與預(yù)期大小相一致（M 1 2 3

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